黑龍江省洋蔥主產(chǎn)區(qū)鱗莖致腐病原分離鑒定

王 勇，高璐瑤，張 鄭，袁巧玲，陳 典

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，哈爾濱 150030；2.農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，哈爾濱 150030）

洋蔥（Allium cepa L.），別名球蔥、玉蔥、荷蘭蔥，為蔥科蔥屬二年生植物，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健和食品等領(lǐng)域[1]，近年來隨洋蔥種植面積及市場需求量遞增，氣候環(huán)境改變，洋蔥病害凸顯。軟腐病、黃矮病、霜霉病、紫斑病等為洋蔥常見病害，我國洋蔥產(chǎn)區(qū)有甘肅、內(nèi)蒙古、新疆、黑龍江、吉林、山東、河南、云南等地。在黃河及以南地區(qū)，洋蔥栽培方式為秋播，病害發(fā)生相對較少，黑龍江省洋蔥為春播栽培模式，產(chǎn)量形成時期恰為高溫多雨季節(jié)，病害發(fā)生普遍，危害程度嚴(yán)重[2]，特別是生長后期，洋蔥鱗莖常出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象[3]。明確致病菌，篩選抗源材料，培育抗病品種，加強栽培管理措施、防治害蟲、結(jié)合藥劑綜合防治，可有效降低病害發(fā)生。

此前，普遍認(rèn)為洋蔥軟腐病病原菌為胡蘿卜軟腐歐氏桿狀細(xì)菌胡蘿卜致病型（胡蘿卜軟腐歐式桿菌）（Erwinia carotovora subsp carotovora(Jones)Bergey et al.）[4]，該病原侵染植株后，感病鱗莖中心鱗片先腐爛，外部不易發(fā)現(xiàn)，發(fā)病后球莖變軟，后期大量菌液溢出[5]。但近年，黑龍江省洋蔥鱗莖腐爛病害呈多樣化，侵染點分別轉(zhuǎn)移至葉鞘部、莖盤基部、鱗莖夾層部位，逐漸腐爛。目前尚無不同腐爛類型病原的系統(tǒng)分類研究。為此，在黑龍江省哈爾濱、齊齊哈爾和牡丹江三地采集洋蔥病樣，分離培養(yǎng)病原菌，結(jié)合形態(tài)鑒定和16SrDNA序列分析，鑒定病原菌，為洋蔥抗源材料篩選和病害綜合防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

洋蔥腐爛鱗莖于2016年7月至8月在黑龍江省哈爾濱市東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗站、齊齊哈爾市梅里斯區(qū)、牡丹江寧安鎮(zhèn)等地采集，取病健交界組織作病原分離鑒定，病樣采集及處理等參照李煥玲試驗方法[6]。

1.2 病原菌分離

將洋蔥腐爛鱗莖用蒸餾水沖洗1～3 min，75%酒精擦洗表皮，表面消毒，無菌水反復(fù)沖洗3次。在無菌操作臺中，用滅菌手術(shù)刀片將洋蔥鱗莖對半剖開，染病鱗莖病健交界處切取1～3 cm小塊組織，置于研缽中研磨，加入少量滅菌水稀釋，靜置使致病菌溶于無菌水中，采用平板劃線法分離病原菌。用接種針蘸取洋蔥病健交界處組織提取液，分別在NA和CVP培養(yǎng)基上劃線，28℃恒溫培養(yǎng)24 h，待菌落長出后分離純化[7-9]。

將純化后細(xì)菌調(diào)至3×108CFU·mL-1，接種于洋蔥健康鱗片上，7d后觀察發(fā)病情況。根據(jù)柯赫氏法則，從發(fā)病洋蔥鱗莖上分離純化病原菌，與原菌落形態(tài)、顏色等生理生化性狀作比較，確定致病菌株。

挑取菌液置于15%滅菌甘油中，-20℃保存于滅菌離心管。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)性狀觀察

采用劃線法將各菌株在NA培養(yǎng)基上28℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落質(zhì)地、形狀、尺寸、邊緣、表面隆起形狀、透明度、菌落及培養(yǎng)基顏色等培養(yǎng)性狀[10]。

1.3.2 革蘭氏染色

采用結(jié)晶紫草酸銨染色法染色后[11]，S-3 400N掃描電鏡下，觀察單細(xì)胞形態(tài)。

1.3.3 生理生化測定

試驗菌株作生理生化測試[6]，主要包括吲哚產(chǎn)生、明膠液化、酷素水解、酷氨酸水解、檸檬酸鹽及丙二酸鹽利用等生理生化指標(biāo)測定。

1.3.4 細(xì)菌16SrDNA序列分析

擴繁候選菌株，細(xì)菌基因組DNA提取方法采用CTAB法[12]。對分離致病細(xì)菌作聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增，PCR擴增引物根據(jù)16S rDNA兩端恒定序列設(shè)計，上游引物為27F：5'-CCGGATCC AGAGTTTGATCATGGCTCAGCA-3'，下游引物為1492R：5'-CGGGATCCTACGGCTACCTTGTTACGA CTT-3'）。PCR擴增反應(yīng)體系為：10×PCR Buffer，2μL；10 mmol·L-1dNTP，0.2μL；10 mmol·L-127F，1492R各1 μL； 10 ng·μL-1模板DNA，1 μL；Taq DNA聚合，0.2μL；ddH2O補足至20 μL。PCR擴增反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30個循環(huán)，之后72℃延伸10 min，4℃保存，具體參考張艷菊等方法[13]，擴增產(chǎn)物送至華大基因測序后，于NCBI網(wǎng)站Blast搜索，通過DNAMAN 6.0比對序列間同源性[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

洋蔥發(fā)病鱗莖有3種腐爛表現(xiàn)（見圖1）：一為病原菌從鱗莖葉鞘基部侵入，葉鞘向鱗莖內(nèi)縮，內(nèi)部鱗片先腐爛，由內(nèi)而外逐漸發(fā)病，同時伴有腐爛臭味；二為鱗莖夾層鱗片感染病菌開始腐爛，之后向內(nèi)部鱗莖浸染，浸染速度較慢；三為病原菌由鱗莖莖盤基部侵入，從鱗莖內(nèi)部腐爛并向外皮延伸，發(fā)病初期外觀不明顯，后期手壓軟化，發(fā)病嚴(yán)重時有汁液流出。

2.2 洋蔥鱗莖致腐病原分離

致腐病原菌分離采用平板劃線法，將病健交界組織提取液分別劃線培養(yǎng)于NA、CVP培養(yǎng)基上，挑取單菌落純化培養(yǎng)。在NA培養(yǎng)基中分離12種菌株，分別編號W-1至W-12，其中W-1至W-4來自葉鞘基部腐爛病樣，W-5至W-8來自夾層鱗片腐爛病樣，W-9至W-12來自莖盤基部腐爛病樣；在CVP培養(yǎng)上純化培養(yǎng)獲得菌株9種，分別編號為Z-1至Z-9。Z-1至Z-3菌株來自葉鞘基部腐爛病樣，Z-4至Z-6菌株來自夾層鱗片腐爛鱗莖病樣，Z-7至Z-9菌株來自莖盤基部鱗莖病樣。

圖1 洋蔥鱗莖腐爛田間發(fā)病癥狀Fig.1 Soft rot of onion bulb in thefield

2.3 致病性測定

將分離得21種菌株，參考呂和平等方法[16]，以離體回接方式回接至洋蔥鱗片，調(diào)查各菌株致病情況。在所分離獲菌株中，18種菌株對洋蔥無致病性，發(fā)病率為0；W-1、W-5、Z-7 3種菌株對洋蔥具致病性，其中W-1發(fā)病率低，W-5、Z-7發(fā)病率相對較高，均在60%以上，因此判斷W-5和Z-7為主要致病菌株。W-5來自鱗莖夾層鱗片腐爛病樣，另一種主要致病菌株Z-7來自莖盤基部腐爛病樣，2種菌株致腐癥狀與采集發(fā)病洋蔥鱗片腐爛癥狀一致（見圖2）。將接種后發(fā)病鱗莖再分離，病原菌與原接種菌一致，說明2種菌株均為洋蔥鱗莖軟腐病致病菌株。

2.4 病原菌鑒定

2.4.1 形態(tài)鑒定

2種菌株中的W-5在培養(yǎng)基中菌落呈圓形或近圓形，不透明，乳白色，稍隆起，邊緣整齊，光滑發(fā)亮，28℃條件下在NA培養(yǎng)基上生長良好。致病菌株Z-7在培養(yǎng)基中菌落呈圓形或近圓形，不透明，乳白色略帶紫色，稍隆起，邊緣不規(guī)則，28℃條件下在CVP培養(yǎng)基上生長速度較慢。

表1 回接鑒定結(jié)果Table1 Resultsof theidentification

圖2 回接鑒定Fig.2 Return connection identification

圖3 不同培養(yǎng)基菌株生長狀態(tài)及電鏡觀察Fig.3 Growing strain of different culturemedium and electron microscopeobservation

將致病菌置于電鏡下超微觀察。電鏡下2種致病菌均呈桿狀，但形狀及鞭毛存在差異：菌株W-5菌體為桿狀，長1.0～3.1μm，兩端鈍圓，邊緣整齊，極端生長1～4根鞭毛；菌株Z-7菌體為桿狀，長0.8～3.0μm，極端生長多根鞭毛（見圖3）。

2.4.2 革蘭氏染色及生理生化測定

將致病菌株作革蘭氏陰陽性鑒定。2種菌均可在3%KOH溶液中拉出菌絲，表明W-5、Z-7均為革蘭氏陰性細(xì)菌。

對試驗菌株作生理生化測試，發(fā)現(xiàn)2種菌株在37°C生長狀態(tài)良好，均可使明膠液化，具耐鹽性及過氧化酶活性。在碳源利用上，2種菌株均可利用檸檬酸和丙二酸作為碳源，且可使蛋白胨中色氨酸分解。但W-5可使硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，而Z-7不具備該能力。此外，二者均難以水解酪氨酸，說明其對植物遺傳無分解作用，不是腐生細(xì)菌。結(jié)合2種菌株形態(tài)特征與生理生化特性，初步推測菌株W-5為假單胞菌屬，菌株Z-7為伯克霍爾德菌屬（見表2）。

表2 菌株W-5、Z-7生理生化特點Table2 Physiological and biochemical charactersof strain W-5 and Z-7

表3 W-5與GenBank中登錄菌株r DNA序列同源性比較Table3 Sequencecomparison between W-5 and thoseloaded from GenBank

圖4 細(xì)菌通用引物對病菌模板DNA擴增結(jié)果Fig.4 Resultsof PCR amplification with universal specific primersto genomic DNA

2.4.3 分子鑒定

為進一步確定致病菌種屬關(guān)系，以2種疑似菌株基因組DNA為模板，利用細(xì)菌16SrDNA通用引物（27F，1492R）PCR擴增，2種菌均擴增目的條帶，其大小與預(yù)期一致（見圖4）。將膠回收后PCR產(chǎn)物送華大基因公司測序，測序結(jié)果顯示，菌株W-5和Z-7擴增產(chǎn)物均為1 338 bp。比對分析所得序列與GenBank中核酸序列，Blast對比結(jié)果顯示（見表3），W-5菌株與GenBank中登記號為LT629801.1、KT695839.1、KT695836.1、AB819473.1、KF054779.1和JX994152.1等菌株同源性較高，達99.9%以上，可確定該菌株為羅氏假單胞菌（Pseudomonas rhodesiae）；Z-7菌株與GenBank中登記號為CP019670.1、CP019668.1、CP017238.1、CP019669.1、CP000458.1和CP000378.1等菌株同源性達99.6%以上（見表4），確定該菌株為洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）。

表4 Z-7與GenBank中登錄菌株r DNA序列同源性比較Table4 Sequencecomparison between Z-7 and thoseloaded from GenBank

3 討論與結(jié)論

洋蔥常見病害有紫斑病、霜霉病、疫病、軟腐病等[3]，前幾種病害發(fā)生于生長期間，主要為真菌性病害，而軟腐病在生長后期至貯藏期均有發(fā)生。一些真菌如尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum Schlechtendahl emend.SnyderHansen）和層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum（Matsushina）Nirenberg）可造成洋蔥鱗莖腐爛[16]，但該病大面積發(fā)生仍以細(xì)菌為主要致病菌。為此，本試驗采用細(xì)菌培養(yǎng)基作分離鑒定。

目前已鑒定胡蘿卜軟腐歐文氏桿菌胡蘿卜軟腐亞種（Erwinia carotovora subsp.carotovora）和菊歐文氏桿菌（Erwinia chrysanthemi）及1種腸桿菌科細(xì)菌（Enterobacter sp.）均可導(dǎo)致魔芋腐爛[17]。歐文氏桿菌是馬鈴薯軟腐病主要致病菌，但因地域不同發(fā)生亞種分化：Erwinia carotovora var.carotovora是全國范圍內(nèi)主要病原菌，Erwinia carotovora var.atroseptica主要發(fā)現(xiàn)于黑龍江、青海、河北、甘肅及四川等省，Erwinia chrysanthemi是四川、江蘇、江西及內(nèi)蒙古致病菌株之一[18]。

胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種（Pectobacyerium carotovorum subsp.carotovorum）原名胡蘿卜軟腐歐文氏菌胡蘿卜亞種（Erwinia carotovora subsp.carotovora），是一種寄主廣泛植物病原細(xì)菌，可造成多種作物軟腐病。此前，胡蘿卜軟腐歐氏桿狀細(xì)菌胡蘿卜致病型（Erwinia carotovora subsp.carotovora）被公認(rèn)為洋蔥軟腐病致病菌，其引發(fā)癥狀與本試驗中第三種類型一致，呂和平、徐冬等在甘肅地區(qū)洋蔥病樣中分離出該種病原菌，說明其為造成洋蔥鱗莖腐爛主要致病菌之一[15,19]。胡蘿卜軟腐歐氏桿狀細(xì)菌以聚果膠酸鈉為唯一碳源[20]，本研究中配制CVP培養(yǎng)基以避免遺漏該細(xì)菌，但并未分離出該病菌，僅在相同侵染癥狀病樣中分離出洋蔥伯克霍爾德菌，說明黑龍江省洋蔥軟腐病優(yōu)勢致病菌可能為洋蔥伯克霍爾德菌。

除胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜亞種外，其他細(xì)菌可造成洋蔥鱗莖腐爛，如甘肅地區(qū)格氏沙雷氏菌（Serratia grimesii）。但此前尚無羅氏假單胞菌（Pseudomonas rhodesiae）相關(guān)致病報道。本試驗首次明確羅氏假單胞菌（Pseudomonas rhodesiae）可引起洋蔥鱗莖腐爛，但其侵染循環(huán)和發(fā)病規(guī)律有待進一步研究。本試驗未從葉鞘基部開始腐爛病樣中分離致病菌，可能與細(xì)菌對培養(yǎng)基適應(yīng)度有關(guān)。此外，假單胞菌屬和洋蔥伯克霍爾菌在洋蔥鱗莖腐爛是否存在互作關(guān)系尚不明確。

通過分離鑒定黑龍江省3個地區(qū)洋蔥鱗莖病樣本，經(jīng)菌株分離純化，回接鑒定確定W-5和Z-7為主要致病菌。為確定致病菌菌屬地位，以傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定為基礎(chǔ)，結(jié)合16SrDNA序列分析方法鑒定菌株，結(jié)果顯示，菌株W-5為羅氏假單胞菌（Pseudomonas rhodesiae），侵染可造成洋蔥鱗莖夾層鱗片腐爛，菌株Z-7為洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cenocepacia），與洋蔥鱗莖莖盤基部起始腐爛相關(guān)，對指導(dǎo)洋蔥抗病育種及病害綜合防治具有參考作用。

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