不同方法學(xué)測(cè)定乙型肝炎病毒核心抗體的陽(yáng)性率及其定量檢測(cè)意義的研究

王紅翠 林健聰 吳英松 董志寧 李志雄★

人體感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）后最先產(chǎn)生的抗體為乙型肝炎病毒核心抗體（hepatitis B virus core antibody，anti?HBc），在HBV感染早期即可在血清中檢測(cè)到，常持續(xù)存在終身［1］。目前，anti?HBc常用的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（enzyme?linked immunosorbent as?say，ELISA）、時(shí)間分辨免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法（chemiluminescence immunoassay，CLIA）等。其中，傳統(tǒng)的ELISA方法，通常會(huì)將不稀釋樣本的檢測(cè)結(jié)果作為流行病學(xué)調(diào)查，而將標(biāo)本稀釋檢測(cè)的結(jié)果用于臨床診斷，但據(jù)張碧瑩等［2］的研究顯示，ELISA稀釋法檢測(cè)低濃度anti?HBc時(shí)，易呈假陰性。據(jù)文獻(xiàn)的報(bào)道可知，不同地區(qū)的正常人群中，anti?HBc的陽(yáng)性率不一樣，且普遍呈現(xiàn)陽(yáng)性率高的狀況［3?4］。僅從定性方面檢測(cè) anti?HBc并不能很好的解釋它的臨床意義。有研究顯示，早期（30歲之前）發(fā)生HBeAg血清轉(zhuǎn)換且HBV DNA持續(xù)檢測(cè)不到的慢性乙肝患者，臨床癥狀得到顯著改善，肝纖維化可以逆轉(zhuǎn)［5］。

本研究選用臨床檢測(cè)性能較好的CLIA試劑盒作為對(duì)比試劑，與ELISA試劑盒的稀釋法、不稀釋法同步測(cè)定標(biāo)本的anti?HBc濃度，分析不同方法學(xué)測(cè)定 anti?HBc的陽(yáng)性率，以探討 anti?HBc檢測(cè)試劑的性能。同時(shí)從定量角度探討其不同濃度水平的臨床意義，通過(guò)對(duì)HBeAg陽(yáng)性慢性乙型病毒性肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者的anti?HBc、HBeAg濃度水平進(jìn)行跟蹤研究，以探討anti?HBc定量測(cè)定的臨床意義，并期望對(duì)乙型肝炎的治療、預(yù)后觀察有一定的參考意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

隨機(jī)選取健康查體者的病例400例，年齡在20～60（32±11.54）歲之間，男性 272例，女性 128例，采集血清標(biāo)本，共400例標(biāo)本。另外選取97例CHB 患者（anti?HBc、HBeAg、HBsAg臨床檢測(cè)均為陽(yáng)性的患者，即大三陽(yáng)患者），年齡在15～73（39±13.62）歲之間，男性69例，女性28例，采集其抗乙肝病毒治療前后的血清標(biāo)本，共194例有效標(biāo)本。所有標(biāo)本均來(lái)源于福建福州傳染病醫(yī)院。

1.2 儀器與試劑

雅培貿(mào)易（上海）有限公司（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“雅培公司”）的全自動(dòng)免疫分析儀ARCHITECT i2000sr及配套的anti?HBc測(cè)定試劑盒、校準(zhǔn)品和專(zhuān)用質(zhì)控品。廈門(mén)優(yōu)邁科醫(yī)學(xué)儀器有限公司的全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀Caris200，配套廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“達(dá)瑞公司”）的anti?HBc測(cè)定試劑盒和HBeAg測(cè)定試劑盒及專(zhuān)用的質(zhì)控品。上?？迫A生物工程股份有限公司（以下簡(jiǎn)稱(chēng)“科華公司”）的anti?HBc檢測(cè)試劑盒及質(zhì)控品，配套BIO?RAD公司的酶標(biāo)儀PR 4100。

1.3 方法

1.3.1 試劑定標(biāo)

根據(jù)雅培公司和達(dá)瑞公司的anti?HBc測(cè)定試劑盒的要求，使用定標(biāo)品進(jìn)行定標(biāo)，定標(biāo)合格后，再進(jìn)行下一步的檢測(cè)操作。每天進(jìn)行測(cè)試前先測(cè)定質(zhì)控品濃度，保證定標(biāo)曲線(xiàn)的可靠性?？迫A公司的anti?HBc檢測(cè)試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求，每次實(shí)驗(yàn)使用對(duì)照品進(jìn)行定標(biāo)，并測(cè)定質(zhì)控品，以保證實(shí)驗(yàn)的可靠性。

1.3.2 標(biāo)本采集

對(duì)于隨機(jī)抽取的400例健康查體者，經(jīng)其本人同意將體檢檢測(cè)的剩余標(biāo)本用于科研研究后，采集檢測(cè)剩余的血清標(biāo)本2 mL，于2～8℃短期保存，-20℃長(zhǎng)期儲(chǔ)存。將在醫(yī)院進(jìn)行抗病毒治療的CHB患者納入研究，在獲得病人同意的情況下，采集藥物治療前檢測(cè)剩余的血清標(biāo)本2 mL，經(jīng)3個(gè)月治療后，再次采集檢測(cè)剩余的血清標(biāo)本2 mL，其中排除除了抗病毒藥物治療還進(jìn)行其他治療的患者、標(biāo)本采集相隔時(shí)間不是3個(gè)月的患者、未取得知情同意的患者后，共有97例CHB患者，共194份標(biāo)本，于2～8℃短期保存，-20℃長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

1.3.3 標(biāo)本檢測(cè)

分別采用雅培公司、達(dá)瑞公司和科華公司的anti?HBc試劑盒對(duì)400例健康查體者的標(biāo)本進(jìn)行同步測(cè)定，統(tǒng)計(jì)分析各試劑盒檢測(cè)anti?HBc的陽(yáng)性率。

使用雅培公司、達(dá)瑞公司和科華公司的anti?HBc試劑盒和達(dá)瑞公司的HBeAg測(cè)定試劑盒，對(duì)97例臨床CHB患者藥物治療前后收集的共194份血清標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，并分析評(píng)價(jià)藥物治療前后anti?HBc和HBeAg的濃度變化。

所有實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程，嚴(yán)格按照各公司試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以百分率表示；CHB患者在藥物治療前后anti?HBc濃度變化的比較，采用配對(duì)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析；評(píng)價(jià)不同anti?HBc濃度水平治療前后HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換率，采用卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同廠家試劑檢測(cè)anti?HBc的陽(yáng)性率比較

對(duì)于CHB患者在治療前后收集的共194份血清標(biāo)本，達(dá)瑞公司與其他兩家公司的anti?HBc試劑盒檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，其陰陽(yáng)性符合率為100.0%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果詳見(jiàn)表1。

表1 CHB患者治療前后anti?HBc的陰陽(yáng)性結(jié)果統(tǒng)計(jì)表（n）Table 1 The results of anti?HBc before and after treatment of CHB patients（n）

對(duì)隨機(jī)選取400例健康查體者標(biāo)本進(jìn)行anti?HBc檢測(cè)，達(dá)瑞公司與雅培公司的陰陽(yáng)性符合率為100.0%；科華生物（標(biāo)本1∶30稀釋?zhuān)┡c雅培公司的陽(yáng)性符合率為35.71%，陰性符合率為100.0%，總符合率為73.0%；科華生物（原倍檢測(cè)）與雅培公司的陽(yáng)性符合率為100.0%，陰性符合率為63.21%，總符合率為63.0%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。不同廠家之間的符合率結(jié)果詳見(jiàn)表3。

表2 健康查體者的anti?HBc陰陽(yáng)性結(jié)果統(tǒng)計(jì)表（n）Table 2 The statistics of anti?HBc results of healthy testing groups（n）

2.2 抗病毒治療中的anti?HBc水平及其預(yù)測(cè)意義

2.2.1 CHB患者治療前后的anti?HBc濃度變化

采用達(dá)瑞anti?HBc測(cè)定試劑盒對(duì)97例CHB患者抗病毒治療前后的標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)CHB患者治療前后的anti?HBc濃度水平進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示在抗病毒治療前后，CHB患者的anti?HBc濃度無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表3 健康查體者的anti?HBc檢測(cè)符合率統(tǒng)計(jì)表Table 3 The coincidence rate of anti?HBc results of healthy testing groups

表4 CHB患者治療前后anti?HBc濃度變化配對(duì)t檢驗(yàn)Table 4 The result of t?test pairs of anti?HBc before and after treatment of CHB patients

2.2.2 CHB患者治療前后的HBeAg陽(yáng)性率變化

采用達(dá)瑞HBeAg測(cè)定試劑盒對(duì)97例CHB患者在抗病毒治療前后的標(biāo)本進(jìn)行測(cè)定，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果顯示，97例HBeAg陽(yáng)性的CHB患者經(jīng)過(guò)治療后，有11例患者發(fā)生了HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，即HBeAg變?yōu)殛幮?，血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為11.34%。

2.2.3 不同anti?HBc濃度水平的患者在治療前后HBeAg陽(yáng)性率的變化

根據(jù)達(dá)瑞anti?HBc定量試劑盒測(cè)定CHB患者治療前標(biāo)本的anti?HBc濃度水平，將97例CHB患者標(biāo)本分成anti?HBc高濃度（≥9 000 IU/mL）和an?ti?HBc低濃度（＜9 000 IU/mL）兩組，對(duì)比兩組患者的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率，結(jié)果顯示anti?HBc高濃度組（≥9 000 IU/m）的患者經(jīng)過(guò)治療后，其HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為20.83%；anti?HBc低濃度組（＜9 000 IU/mL）的患者經(jīng)過(guò)治療后，其HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為2.04%。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，anti?HBc高濃度組HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率比anti?HBc低濃度組的明顯增高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果詳見(jiàn)表6、表7所示。

表5 CHB患者治療前后HBeAg陰陽(yáng)性的變化情況Table 5 The results of HBeAg before and after treatment of CHB patients

表6 anti?HBc高低濃度組間治療前后HBeAg發(fā)生血清學(xué)轉(zhuǎn)換的統(tǒng)計(jì)Table 6 The results of HBeAg seroconversion between high and low anti?HBc concentration groups

3 討論

HBcAg主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)和血清Dana顆粒中，與anti?HBc具有很強(qiáng)的親和力，能迅速結(jié)合形成免疫復(fù)合物，故難以在血清中測(cè)得游離的HBcAg，所以臨床上以檢測(cè)anti?HBc來(lái)間接反映HBcAg的水平［6］。由于HBcAg較HBV表面抗原有更高的免疫原性，故anti?HBc較其他HBV抗體更早產(chǎn)生，并且有更高的血清水平，以及更長(zhǎng)久的存在時(shí)間，無(wú)論肝病是否存在或病毒已否消除，anti?HBc 可持續(xù)存在數(shù)十年，因此 anti?HBc 成為了臨床診斷HBV與流行病學(xué)調(diào)查最有價(jià)值的血清標(biāo)志物之一［7］。作為流行病學(xué)調(diào)查的標(biāo)志物之一，不同地區(qū)、不同年齡段的人群，其anti?HBc檢測(cè)的陽(yáng)性率均有所差異，此外檢測(cè)的方法學(xué)和試劑，也是影響其檢測(cè)陽(yáng)性率的重要因素［8?9］。

表7 anti?HBc高低濃度組間治療前后HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的卡方檢驗(yàn)Table 7 The chi?square test of HBeAg seroconversion between high and low anti?HBc concentration groups

在本次研究中，使用兩種CLIA的檢測(cè)試劑盒、一種ELISA的檢測(cè)試劑盒，對(duì)400例健康查體者的標(biāo)本進(jìn)行了anti?HBc檢測(cè)，其中達(dá)瑞公司與雅培公司的陽(yáng)性率均為42.0%，陰陽(yáng)性符合率為100.0%，說(shuō)明兩家公司anti?HBc試劑盒的檢測(cè)結(jié)果符合率高，具有很高的一致性。另外，本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，科華公司的ELISA法anti?HBc檢測(cè)試劑盒，其測(cè)定不稀釋的健康查體者標(biāo)本時(shí)，anti?HBc的陽(yáng)性率為79.0%，比CLIA試劑盒的更高，而測(cè)定經(jīng)過(guò)稀釋的健康查體者標(biāo)本時(shí)，其陽(yáng)性率為15.0%，比CLIA 試劑盒的低，該結(jié)果與陸盈［10］、汪詠新等［11］等的研究結(jié)果一致。以雅培公司的檢測(cè)結(jié)果作為測(cè)定anti?HBc的金標(biāo)準(zhǔn)，則達(dá)瑞公司的檢測(cè)結(jié)果與雅培公司一致，ELISA試劑盒測(cè)定不稀釋的標(biāo)本時(shí)，假陽(yáng)性率較高，測(cè)定稀釋標(biāo)本時(shí)，出現(xiàn)漏檢率較高。對(duì)于該情況，李金明［12］教授提出一種理論，認(rèn)為anti?HBc的假陽(yáng)性，可能是由血清（漿）中存在交叉反應(yīng)性抗體或干擾物質(zhì)導(dǎo)致的，如前母B淋巴細(xì)胞的非特異激活，導(dǎo)致未感染HBV的IgA或IgM相關(guān)分子的產(chǎn)生，可能會(huì)導(dǎo)致anti?HBc假陽(yáng)性。在這種情況下，使用還原劑，如二硫蘇糖醇、重亞硫酸鉀和半胱氨酸等預(yù)處理血清標(biāo)本將明顯改善anti?HBc檢測(cè)的特異性。其中雅培公司、達(dá)瑞公司的anti?HBc測(cè)定試劑盒，均需要對(duì)標(biāo)本進(jìn)行預(yù)處理，本研究中使用其測(cè)定健康查體者的陽(yáng)性率均為42.0%，明顯低于無(wú)預(yù)處理的ELISA anti?HBc試劑盒測(cè)定不稀釋標(biāo)本的79.0%，高于測(cè)定稀釋標(biāo)本的15.0%。由于雅培公司的檢測(cè)結(jié)果更受?chē)?guó)內(nèi)外市場(chǎng)的認(rèn)可，故臨床上建議選用與雅培公司測(cè)值符合率較高的國(guó)產(chǎn)CLIA anti?HBc試劑盒，以降低ELISA anti?HBc試劑盒測(cè)定不稀釋標(biāo)本的假陽(yáng)性率和測(cè)定稀釋標(biāo)本的漏檢率。

根據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南》（2015年版）［13］的指導(dǎo)意見(jiàn)，HBeAg陽(yáng)性患者，藥物治療的滿(mǎn)意終點(diǎn)是停藥后獲得持續(xù)的病毒性應(yīng)答，谷丙轉(zhuǎn)氨酶復(fù)常，并伴有HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，故本研究對(duì)97例CHB患者的anti?HBc水平和HBeAg水平進(jìn)行了跟蹤檢測(cè)，結(jié)果顯示在抗病毒治療前后，CHB患者的anti?HBc濃度無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；97例HBeAg陽(yáng)性的CHB患者經(jīng)過(guò)治療后，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為11.34%，anti?HBc高濃度（≥9 000 IU/mL）組的HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率為20.83%，明顯高于anti?HBc低濃度（＜9 000 IU/mL）組的2.04%，該差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。故通過(guò)測(cè)定HBeAg陽(yáng)性CHB患者的anti HBc水平，可預(yù)測(cè)患者抗病毒藥物治療的效果，anti?HBc濃度高（≥9 000 IU/mL）的患者，其HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)化率高，抗病毒藥物的治療效果更好；而低濃度anti?HBc（＜9 000 IU/mL）的患者，HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)化率低，對(duì)治療不敏感。據(jù)袁權(quán)、Fan 等［1，14?16］的報(bào)道，在接受ADV和PegIFN治療的HBeAg陽(yáng)性病人中，基線(xiàn)anti?HBc水平能有效預(yù)測(cè)治療后HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換應(yīng)答情況，基線(xiàn)anti?HBc水平高的病人（ADV治療病人≥29 000 IU/mL；PegIFN治療病人≥9 000 IU/mL）較基線(xiàn)anti?HBc水平低者治療后（隨訪終點(diǎn)）HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換率更高。該研究結(jié)果與本研究的發(fā)現(xiàn)一致，本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了anti?HBc這一經(jīng)典HBV血清學(xué)指標(biāo)的定量檢測(cè)，對(duì)HBeAg陽(yáng)性CHB患者的藥物治療效果有預(yù)測(cè)作用，對(duì)anti?HBc的進(jìn)一步臨床應(yīng)用、CHB患者的治療和預(yù)后觀察有著重大的意義。

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