新型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)開發(fā)與應(yīng)用研究進(jìn)展

張亞平 鄭志高 簡(jiǎn)保磊 朱巍巍

傳統(tǒng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain re?action，PCR）由于需要3個(gè)不同的熱循環(huán)，還需要對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳或熒光標(biāo)記等多種操作，大大限制了其在口岸檢測(cè)和產(chǎn)地檢測(cè)等現(xiàn)場(chǎng)平臺(tái)上的應(yīng)用。隨著技術(shù)發(fā)展，已經(jīng)開發(fā)了更加方便的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)如核酸序列基礎(chǔ)擴(kuò)增（nucleic acid sequence?based amplification，NASBA）、旋轉(zhuǎn)聚合酶擴(kuò)增（rotational polymerase amplification，RPA）、解旋酶依賴擴(kuò)增（helicase dependent amplification，HDA）、聚合酶螺旋擴(kuò)增（polymerase spiral amplifi?cation，PSR）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop?mediated iso?thermal amplification，LAMP），其中 LAMP 技術(shù)是最具有代表性的等溫（60～65℃）核酸擴(kuò)增程序。該技術(shù)通過使用一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶（BstDNA polymerase）和一套共4條引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)首次報(bào)道于2000年，目前已經(jīng)經(jīng)歷了十余年的研究和發(fā)展，廣泛用于單核苷酸多態(tài)性、病毒和病原體檢測(cè)［1］。隨著越來越多的科學(xué)家研究LAMP技術(shù)，使得此技術(shù)使用范圍不再局限于病原微生物的檢測(cè)和定量，LAMP技術(shù)也應(yīng)用于寄生蟲和胚胎鑒定領(lǐng)域。Yeeling等［2］介紹了LAMP技術(shù)檢測(cè)弓形蟲。最近，用于檢測(cè)寄生蟲的LAMP試劑已經(jīng)被商業(yè)化。Zoheir等［3］使用LAMP方法用于牛胚胎性別鑒定。同時(shí)，研究人員也在尋找一些其他能夠與LAMP結(jié)合使用的技術(shù)，使檢測(cè)技術(shù)更加優(yōu)化。例如，Wang等［4］開發(fā)了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增?橫向流動(dòng)試紙條技術(shù)（loop?mediat?ed isothermal amplification ?lateral flow dipstick，LAMP?LFD）用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆，這種新的方法結(jié)合了免疫層析和LAMP技術(shù)，成功地把LAMP技術(shù)應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)。另外，根據(jù)實(shí)際檢測(cè)需求，研究人員對(duì)此技術(shù)進(jìn)行大量改進(jìn)，主要集中在提高特異性、加快反應(yīng)速度、簡(jiǎn)化樣本處理、實(shí)現(xiàn)多重?cái)U(kuò)增以及應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)平臺(tái)等方面。本綜述回顧了近年對(duì)LAMP技術(shù)本身簡(jiǎn)單化、快速化和產(chǎn)物檢測(cè)特異化等方面的改進(jìn)所進(jìn)行的研究，同時(shí)總結(jié)了近期開發(fā)應(yīng)用的新型LAMP檢測(cè)技術(shù)，為環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的發(fā)展和實(shí)際應(yīng)用提供依據(jù)。

1 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的基本原理及優(yōu)勢(shì)

LAMP體系的反應(yīng)溫度之所以在60～65℃范圍內(nèi)，一是因?yàn)锽stDNA聚合酶在此溫度下才具有活性，二是因?yàn)檫@是雙鏈DNA發(fā)生復(fù)性和延伸的中間溫度，DNA會(huì)呈現(xiàn)一種動(dòng)態(tài)平衡的狀態(tài)，其中任何一條引物與DNA結(jié)合并發(fā)生擴(kuò)增時(shí)，另一條鏈會(huì)自動(dòng)脫落形成單鏈，在酶的作用下不斷發(fā)生鏈置換反應(yīng)，不斷自我循環(huán)［5］。LAMP反應(yīng)被人為地劃分成2個(gè)擴(kuò)增階段：第一階段為起始階段，主要為了形成第二階段循環(huán)的起始復(fù)合物—“頸環(huán)結(jié)構(gòu)”；第二階段是擴(kuò)增循環(huán)階段，以“頸環(huán)結(jié)構(gòu)”作為第二階段擴(kuò)增反應(yīng)的模板，啟動(dòng)新一輪鏈置換反應(yīng)，最終獲得含有不同數(shù)量的頸環(huán)結(jié)構(gòu)、不同長(zhǎng)度的DNA混合物，且產(chǎn)物是對(duì)靶序列的交替反應(yīng)擴(kuò)增的重復(fù)序列［6］。

LAMP是一種新的檢測(cè)技術(shù)，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。第一，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，LAMP檢測(cè)的特異性高。4條引物分別用來擴(kuò)增6個(gè)不同靶區(qū)域，一旦任何一個(gè)引物不能準(zhǔn)確匹配，將會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)不能發(fā)生，也就是說理論上將顯著降低非特異擴(kuò)增的發(fā)生［7］。第二，LAMP的靈敏度比傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)高10～100倍，其檢測(cè)限達(dá)到10個(gè)拷貝或者更低。換言之，LAMP技術(shù)可以在很早期階段，或者在臨床癥狀不明階段，檢測(cè)到疾病的發(fā)生［8］。第三，檢測(cè)時(shí)間比傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增檢測(cè)縮短很多。LAMP具有高度的擴(kuò)增有效性，其主要?dú)w因于無需復(fù)雜的變溫條件和不同的反應(yīng)程序。LAMP技術(shù)能夠在 15～60 min 內(nèi)，使 DNA 擴(kuò)增 109～1010倍，故與傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增相比檢測(cè)時(shí)間能夠縮短1 h左右［9］。最后，LAMP技術(shù)最大的優(yōu)勢(shì)是操作簡(jiǎn)單和可視化檢測(cè)［10］。例如，當(dāng)運(yùn)用LAMP技術(shù)檢測(cè)病原微生物時(shí)，可以直接通過動(dòng)物疾病組織的核酸進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)，而不需要進(jìn)行單獨(dú)的細(xì)菌培養(yǎng)和復(fù)雜的核酸提取步驟。同時(shí)，LAMP反應(yīng)僅需一臺(tái)恒溫設(shè)備如水浴鍋或恒溫箱就能滿足對(duì)實(shí)驗(yàn)的基本需求，其反應(yīng)設(shè)備簡(jiǎn)單。另外，LAMP反應(yīng)合成大量核酸分子的過程中，會(huì)產(chǎn)生大量的焦磷酸離子，與反應(yīng)液中Mg2+結(jié)合生成不溶于水的焦磷酸鎂，經(jīng)過離心后可以通過肉眼觀察是否有白色沉淀生成從而鑒定是否發(fā)生核酸擴(kuò)增，也可以在體系中加入適量顏色指示劑如鈣黃綠素、羥基萘酚藍(lán)、SYBR Green I等，通過相應(yīng)的顏色變化直接呈現(xiàn)出擴(kuò)增的結(jié)果。

2 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)改進(jìn)

2.1 操作簡(jiǎn)單化與快速化

LAMP技術(shù)相較于基礎(chǔ)PCR檢測(cè)技術(shù)最具特色的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單、快速。目前，LAMP技術(shù)的改進(jìn)主要集中在進(jìn)一步增強(qiáng)和發(fā)揮這2方面的優(yōu)勢(shì)。

LAMP反應(yīng)簡(jiǎn)單化目標(biāo)之一是簡(jiǎn)化加熱方法。因?yàn)長(zhǎng)AMP技術(shù)是一個(gè)等溫?cái)U(kuò)增方法，LAMP可以通過一個(gè)簡(jiǎn)單的加熱器如加熱盒和水浴槽來進(jìn)行。因此，非電力依賴的加熱系統(tǒng)使LAMP能夠在任何時(shí)間和任何地方進(jìn)行。LaBarre等［11］最近設(shè)計(jì)了一個(gè)非電力依賴的水浴系統(tǒng)，利用一個(gè)變相材料，使用化學(xué)產(chǎn)熱。Curtis等［12］同樣開發(fā)了一個(gè)相似的化學(xué)加熱器，并成功用于HIV病毒檢測(cè)。另外，Hatano等［13］憑借一個(gè)可任意使用的口袋取暖器利用LAMP技術(shù)成功檢測(cè)炭疽，并驗(yàn)證他們的系統(tǒng)是一個(gè)快速、可靠的檢測(cè)方法。Nkouawa等［14］使用一個(gè)保溫的熱水瓶進(jìn)行了LAMP分析，并報(bào)道此系統(tǒng)能夠成功用于檢測(cè)人類糞便樣品中的鏈狀帶絳蟲。這些都是簡(jiǎn)化LAMP技術(shù)加熱步驟的方法。

最近，新英格蘭生物實(shí)驗(yàn)室開發(fā)一個(gè)新DNA聚合酶，叫做Bst2.0或WarmStart Bst2.0。Tanner等［15］評(píng)估了這些新的聚合酶在LAMP檢測(cè)中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)Bst2.0與野生的Bst DNA聚合酶相比，能夠催化更快的LAMP反應(yīng)速度。這些發(fā)現(xiàn)表明，開發(fā)新的DNA聚合酶是改進(jìn)LAMP技術(shù)快速化的關(guān)鍵因素。

超速提?。╬rocedure for the ultra?rapid extrac?tion，PURE）方法是一種從新鮮唾液中直接提取結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，TB）細(xì)胞的技術(shù)［16］。該技術(shù)通過使用一種吸附粉末來移除樣品中的DNA抑制劑，從而保護(hù)樣品中的DNA。并且，此技術(shù)無需復(fù)雜的設(shè)備如離心機(jī)，可以在發(fā)展中國(guó)家落后的地區(qū)使用。Nakauchi等［17］研究了一個(gè)方便使用的檢測(cè)流感病毒的提取試劑，把咽喉或鼻拭子在此試劑中攪拌幾次，即可提取流感病毒基因組RNA，同時(shí)還能消除RNA抑制劑。與其他實(shí)驗(yàn)室所進(jìn)行的前處理方法相比，這一技術(shù)無需加熱和離心。目前，這一提取試劑僅限于流感病毒的提取。Aydin?Schmidt等［18］開發(fā)了高通量DNA提取系統(tǒng)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（high throughput DNA extraction system for loop mediated isothermal amplification，HTP?LAMP），用于檢測(cè)無癥狀人群瘧原蟲，通過商品化的和計(jì)算機(jī)控制的高通量DNA提取系統(tǒng)能夠同時(shí)提取96個(gè)樣品，其提取液可直接用于LAMP檢測(cè)，并在2 h內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果。與傳統(tǒng)PCR檢測(cè)結(jié)果相比，HTP?LAMP檢測(cè)靈敏度為 40.8%（95%CI：27.0～55.8），特異性為 99.9%（95%CI：99.8～100）［18］。超速提取方法能夠大大縮短樣品中核酸的提取時(shí)間，從而提高LAMP的檢測(cè)速度，適合在大樣本檢測(cè)中使用。

2.2 檢測(cè)特異化

目前，通過簡(jiǎn)單的目視檢測(cè)技術(shù)來判斷LAMP擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果已經(jīng)有很大發(fā)展［19?20］。然而，近年來已經(jīng)開始關(guān)注不同的判斷方法［21］。在LAMP反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記探針，反應(yīng)完成后，再加入低分子量的陽離子多聚物乙烯亞胺（polyethyleni?mine，PEI），產(chǎn)生PEI?DNA?probe復(fù)合物沉淀，在紫外燈下通過觀察顏色變化即可實(shí)現(xiàn)特異性檢測(cè)［22］。Seetang?Nun 等［23］將納米金顆粒標(biāo)記的DNA探針與LAMP相結(jié)合，建立了通過肉眼觀察鑒定白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）的LAMP方法，此方法靈敏度可達(dá)200個(gè)拷貝，還可以用紫外可見光光譜進(jìn)行定量。Na?gatani等［24］最早將電化學(xué)方法應(yīng)用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)LAMP反應(yīng)，他們將絲網(wǎng)印刷碳電極浸入離心管中并用亞甲基藍(lán)作為雜交指示劑，擴(kuò)增產(chǎn)物與亞甲基藍(lán)結(jié)合后向電極表面緩慢彌散，引起峰電流的降低，從而進(jìn)行半實(shí)時(shí)定量。Satoh等［25］報(bào)告了一個(gè)通過電化學(xué)活性嵌入劑檢測(cè)特異DNA序列的方法，這一技術(shù)用于臨床檢測(cè)人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV），命名為“Clinichip HPV”。Siddique等［26］開發(fā)了一種基于groEL基因的遺傳標(biāo)記的LAMP檢測(cè)技術(shù)，用于檢測(cè)受污染海鮮和水體中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyti?cus），其檢測(cè)限為100 fg/μL，高于PCR檢測(cè)的100倍。以上這些方法都能顯著提高LAMP技術(shù)檢測(cè)的特異性。

3 新型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

對(duì)蛋白生物標(biāo)志物的高靈敏度和特異性檢測(cè)，在臨床疾病診斷和治療預(yù)后中顯得非常重要。粘蛋白1（mucin 1 protein），作為一種腫瘤標(biāo)志物，存在于許多惡性腫瘤中，如結(jié)直腸癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、卵巢癌、膀胱癌等［27?29］。粘蛋白1在人正常上皮細(xì)胞表達(dá)非常低，因此對(duì)其進(jìn)行靈敏度和特異性檢測(cè)在早期腫瘤診斷中就顯得非常必要。最近，Joo等［30］報(bào)道了不同的免疫環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（immuno?LAMP）平臺(tái)用于檢測(cè)蛋白質(zhì)。免疫環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包含2個(gè)主要步驟，信號(hào)擴(kuò)增和超敏檢測(cè)。為了提高蛋白檢測(cè)的特異性和靈敏度，使用親和配體用于靶蛋白分子的識(shí)別［31?32］。配體為系列合成的DNA或RNA分子，具有高特異性和高親和性。Cao等［33］通過高親和粘蛋白1配體，開發(fā)出一種配體介導(dǎo)的免疫環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，用于定量檢測(cè)人血清樣品中粘蛋白1。其重要步驟為，生物素標(biāo)記的粘蛋白1固定在鏈霉親和素磁珠上，與粘蛋白1配體孵育；游離的粘蛋白1配體通過磁珠分離，蛋白結(jié)合的配體結(jié)構(gòu)通過加熱后解離；最后，解離的配體作為F3引物，通過re?al?time immuno?LAMP 技術(shù)進(jìn)行定量。因此，im?muno?LAMP核酸擴(kuò)增信號(hào)等同于F3引物的量，并且間接反映粘蛋白1的量。此種方法檢測(cè)限可達(dá)120個(gè)分子。

由于食物來源病原體微生物能夠引起嚴(yán)重的疾病，并可能導(dǎo)致巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此通過分子檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)食物來源病原體來預(yù)防嚴(yán)重?fù)p失是非常必要的［34?35］。Seo 等［36］研究開發(fā)了一種高通量、微型離心裝置、基于比色法的食品來源病原體的檢測(cè)方法。開發(fā)的離心微型裝置包括一個(gè)樣品容器，一個(gè)螺旋形樣品注射微通道，24個(gè)腔室（每個(gè)2.5 μL），交叉毛細(xì)管閥門和24個(gè)反應(yīng)室。裝載樣品后行850 r/min離心，使得樣品溶液分布到24個(gè)等體積的腔室內(nèi)。然后，腔室內(nèi)的樣品可以被注射到反應(yīng)室內(nèi)，5 000 r/min離心，離心裝置放置于66℃溫箱中進(jìn)行靶基因的擴(kuò)增。對(duì)于基因擴(kuò)增方法，使用LAMP技術(shù)對(duì)3種食物來源病原體（大腸桿菌O157：H7，鼠傷寒沙門氏菌和副溶血性弧菌）進(jìn)行檢測(cè)。通過鉻黑T（eriochrome black T，EBT）介導(dǎo)的顏色變化（從紫色到天藍(lán)色）來確定病原體的存在，通過綠/紅（G/R）和藍(lán)/紅（B/R）比值來區(qū)分陽性結(jié)果和陰性結(jié)果，整個(gè)分析過程在1 h內(nèi)完成。DNA的檢測(cè)限為500個(gè)拷貝，細(xì)菌的檢測(cè)限為100個(gè)細(xì)菌數(shù)。因此，這種設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單和制造容易的微型裝置通過自動(dòng)控制2次不同轉(zhuǎn)速的離心，在60 min內(nèi)進(jìn)行基因等溫?cái)U(kuò)增，并且通過肉眼進(jìn)行比色法判斷結(jié)果的方法，為食品工業(yè)提供了一種理想的病原體檢測(cè)方法。

電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）是一種敏感性檢測(cè)方式，其在電極表面產(chǎn)生高能狀態(tài)并且促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移，這種電子轉(zhuǎn)移現(xiàn)象能夠通過激發(fā)光而作為一種強(qiáng)度信號(hào)被檢測(cè)［37］。［Ru（bpy）3］Cl2是一種常用的ECL發(fā)光體。各種ECL生物傳感器需要核酸表面固化。最近，有研究報(bào)道了一種無需固化的ECL技術(shù)，通過設(shè)計(jì)2個(gè)輔助探針進(jìn)行 micro?RNA 檢測(cè)［38］。Roy 等［39］研究了LAMP聯(lián)合ECL技術(shù)對(duì)DNA檢測(cè)和定量分析，經(jīng)由LAMP反應(yīng)擴(kuò)增的目的DNA，通過靜電作用與碳電極表面的［Ru（bpy）3］+2結(jié)合，再通過三丙胺（TPrA）觸發(fā)ECL反應(yīng)從而發(fā)出熒光。他們把這種新技術(shù)用于檢測(cè)不同物種肉中特異序列的DNA水平。例如，從野豬肉中檢測(cè)到1 pg/μL（3.43×10?1copies/μL）的靶 DNA。對(duì)枯草桿菌（Bacillus subtilis）DNA 樣品的檢測(cè)限為 10 pg/μL（2.2×103copies/μL）。因此，這種方法的優(yōu)勢(shì)是快速檢測(cè)、最低限度的儀器使用以及更少的試劑使用。把具有高敏感性和特異性的ECL技術(shù)與LAMP快速擴(kuò)增技術(shù)結(jié)合起來成為一種有效的定量核酸檢測(cè)技術(shù)，這種技術(shù)滿足現(xiàn)代核酸檢測(cè)中快速、敏感性、特異性、易于操作以及設(shè)備微型化的要求。

目前LAMP技術(shù)主要的缺點(diǎn)是結(jié)果評(píng)估的間接性，其擴(kuò)增產(chǎn)物通過電泳、SYBR Green I染色、沉淀、羥基萘酚藍(lán)染色、濁度法、鈣黃綠素/Mn2+染色以及探針法等方法進(jìn)行確認(rèn)。這些都不能很好區(qū)分陽性產(chǎn)物和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，從而導(dǎo)致假陽性。分子信標(biāo)（molecular beacons）具有只與目的DNA片段結(jié)合后才產(chǎn)生熒光信號(hào)的特點(diǎn)，因此作為一種直接的擴(kuò)增產(chǎn)物指示劑，能夠避免假陽性的問題。Liu等［40］研究了一種新型的分子信標(biāo)指示的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（molecular beacon loop?mediated isothermal amplification method，MB?LAMP），明確了LAMP技術(shù)中分子信標(biāo)作為評(píng)估工具的最優(yōu)條件：長(zhǎng)度為25～45 bp，濃度為0.6～1 pmol/μL，反應(yīng)溫度為 60～65℃，并且 MB?LAMP 檢測(cè)靈敏度能夠達(dá)到1×10?6ng/μL。使用分子信標(biāo)指示的LAMP技術(shù)有效降低了檢測(cè)結(jié)果假陽性率。

在食品工業(yè)中，快速檢測(cè)食品來源病原體對(duì)阻止污染食物中病原體擴(kuò)散具有重要意義。Liu等［41］開發(fā)了一種多重實(shí)時(shí)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法（multiplex real?time loop?mediated isothermal ampli?fication，ml?LAMP），在一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌（Salmonella）和副溶血弧菌DNA。在65℃擴(kuò)增60 min后，通過不同的熔解溫度（Tm）來區(qū)分?jǐn)U增產(chǎn)物。使用19種已知的菌株驗(yàn)證多重LAMP技術(shù)特異性，發(fā)現(xiàn)此方法能夠100%地區(qū)分不同菌株，其檢測(cè)限與多重PCR相似。因此，多重LAMP技術(shù)在食品工業(yè)檢測(cè)中具有明顯的優(yōu)勢(shì)，能夠同時(shí)檢測(cè)多種病原菌，節(jié)約了大量時(shí)間和成本。

現(xiàn)場(chǎng)血液樣本的采集、運(yùn)輸、保存等常受到一些條件的限制，尤其是當(dāng)采集樣本數(shù)較多時(shí)，因此亟需探索易于運(yùn)輸、保存、又利于病原體核酸提取的樣本采集方法或措施。FTA卡（flinders technol?ogy associates，F(xiàn)TA）是由特制的濾紙經(jīng)強(qiáng)力變性劑、螯合劑浸泡而成，細(xì)胞與FTA卡接觸后被裂解，其核酸與纖維基質(zhì)結(jié)合，維持樣品中核酸的完整性，保護(hù)核酸免于降解，從而起到保存作用。Peng等［42］開發(fā)了一種聯(lián)合FTA技術(shù)的LAMP檢測(cè)方法，用于植物來源的北方根節(jié)線蟲（Meloido?gyne hapla）檢測(cè)，其檢測(cè)限是普通PCR檢測(cè)的100倍。Wu等［43］同樣運(yùn)用結(jié)合FTA技術(shù)的LAMP檢測(cè)方法檢測(cè)了田鼠巴貝蟲（Babesia microti）感染情況，其檢出限為0.687 fg/μL，而傳統(tǒng)的PCR最低檢測(cè)限為0.687 pg/μL，且20份樣品的陽性符合率為100%，說明此方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡(jiǎn)便、快速，適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。近年新型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)總結(jié)見表1。

表1 近年新型環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)Table 1 Summary of new loop?mediated isothermal amplification technology in recent years

4 展望

LAMP技術(shù)是一種創(chuàng)新性基因擴(kuò)增方法，用來取代熱循環(huán)中的高端設(shè)備，其鏈置換反應(yīng)在等溫條件即可完成。由于其諸多優(yōu)勢(shì)已被廣泛用于核酸檢測(cè)的各個(gè)領(lǐng)域，因此LAMP技術(shù)逐步發(fā)展成為成熟、可靠的分子生物學(xué)診斷分析技術(shù)。另外，LAMP技術(shù)在蛋白生物標(biāo)志物檢測(cè)、食物來源病原體微生物檢測(cè)和轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)方面的發(fā)展，使其作為一個(gè)簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)方法在許多國(guó)家，特別是發(fā)展中國(guó)家廣泛應(yīng)用。然而，LAMP技術(shù)也有一些不容忽視缺點(diǎn)，比如反應(yīng)過程易受污染、檢測(cè)特異性不高，容易出現(xiàn)假陽性，因此LAMP技術(shù)的優(yōu)化道路還很漫長(zhǎng)。在未來的技術(shù)開發(fā)中，需要進(jìn)一步的研究來降低假陽性率，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，使得以LAMP技術(shù)為基礎(chǔ)的核酸檢測(cè)具有更廣的應(yīng)用前景。

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