胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)檢測(cè)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用價(jià)值

張麗科 余學(xué)高 黃彬 劉集鴻

自1997年Lo團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了孕婦外周血中存在胎兒游離DNA（cell?free fetal DNA，cffDNA）以來，基于cffDNA進(jìn)行胎兒疾病的研究迅速成為熱點(diǎn)［1］。產(chǎn)前診斷也逐漸由介入性產(chǎn)前診斷向無創(chuàng)性產(chǎn)前檢測(cè)（non?invasive prenatal testing，NIPT）進(jìn)展。隨著以高通量、自動(dòng)化為顯著特征的下一代測(cè)序（next?generation sequencing，NGS）技術(shù)的誕生，胎兒染色體非整倍體無創(chuàng)檢測(cè)技術(shù)已面向臨床［2］。但大部分的醫(yī)療機(jī)構(gòu)都是收集標(biāo)本后送往具有資質(zhì)的第三方基因檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)，僅有很少一部分醫(yī)療機(jī)構(gòu)運(yùn)用測(cè)序平臺(tái)自主檢測(cè)，對(duì)于NIPT在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)過程中可能存在的問題報(bào)道較少。本文對(duì)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院自主檢測(cè)的1 207例標(biāo)本進(jìn)行回顧性分析，總結(jié)NIPT檢測(cè)的指征構(gòu)成比及分析性能，分析NIPT在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)過程中存在的問題，進(jìn)而探討NIPT在胎兒非整倍體異常診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年1月至12月在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院接受NIPT檢查的孕婦1 207例。孕婦年齡17～51歲，平均年齡（36.70±4.59）歲；孕周9～34周，平均20.5周。NIPT指征：血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)、超聲提示胎兒結(jié)構(gòu)異常、超聲軟指標(biāo)異常、染色體非整倍體生育史、無明確遺傳學(xué)診斷的不良生育史家族史、高齡（預(yù)產(chǎn)年齡≥35歲）。另外，部分孕婦雖無上述指征，但要求行NIPT檢測(cè)，則采用統(tǒng)一知情同意書，充分告知孕婦NIPT的臨床適應(yīng)征、檢測(cè)范圍、局限性及可能存在的風(fēng)險(xiǎn)［3?4］，由孕婦自愿選擇并簽署知情同意書。所有對(duì)象均行B超檢查。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及處理

①采用EDTA抗凝管收集孕婦外周血6 mL，8 h內(nèi)依次以4℃2 890 r/min離心10 min，13 000 r/min離心10 min進(jìn)行血漿分離，每管650 μL分裝后80℃保存。②應(yīng)用DNA提取試劑盒，磁珠分離法抽提樣品DNA（QIAGEN，德國(guó)）。③所提取的血漿DNA應(yīng)用 T4DNA聚合酶（T4 DNApolymer?ase）、T4多聚核苷酸激酶（T4 PNK）、克列諾酶（Klenow enzyme）進(jìn)行末端補(bǔ)平。在3′末端加堿基“A”，在DNA片段末端加上特定接頭，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增兩端帶有接頭的DNA片段，最終獲得對(duì)應(yīng)樣本的DNA文庫(kù)。將所得樣本DNA文庫(kù)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，最后上機(jī)測(cè)序。

1.2.2 高通量基因測(cè)序產(chǎn)前篩查檢測(cè)

采用Illumina Nextseq500二代測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。獲得不低于400 M的有效reads數(shù)，平均每個(gè)樣本不低于4 M的reads。運(yùn)行序列比對(duì)軟件BWA map將測(cè)序所得序列與人類基因組參考序列圖譜比對(duì)。使用廣州萬德基因醫(yī)學(xué)科技有限公司NIPT分析系統(tǒng)針對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行每條染色體序列個(gè)數(shù)統(tǒng)計(jì)。采用生物信息學(xué)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)算Z值，利用Z值來評(píng)估胎兒患病風(fēng)險(xiǎn)（cut off：|Z|=3）。Z＞3代表該染色體可能是三倍體，Z＜?3代表該染色體可能是單倍體或者存在缺失。對(duì)NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦建議行介入性產(chǎn)前診斷及胎兒染色體核型分析。

1.2.3 結(jié)果驗(yàn)證及隨訪

對(duì)檢測(cè)結(jié)果為高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，建議行介入性穿刺及胎兒染色體核型分析。對(duì)檢測(cè)結(jié)果為低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦進(jìn)行生育前后隨訪。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示；計(jì)數(shù)資料采用描述性分析，用頻數(shù)和頻率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 1 207例NIPT檢測(cè)的孕婦信息分析結(jié)果

1 207例選擇NIPT的孕婦，包括雙胎妊娠35例，單胎妊娠1 172例；高齡妊娠755例（62.55%），低齡妊娠452例（37.45%）；不良孕產(chǎn)史208例（17.23%）；孕婦無指征但要求檢測(cè)165例（13.67%）。443例有行血清學(xué)篩查試驗(yàn)（36.70%），其中21?三體綜合征（21?trisomy syndrome ，T21）臨界風(fēng)險(xiǎn)與高風(fēng)險(xiǎn)共 291 例，18?三體綜合征（18?tri?somy syndrome，T18）臨界風(fēng)險(xiǎn)與高風(fēng)險(xiǎn)共21例，異常率為25.85%。B超檢查結(jié)果顯示：正常1 183例，異常24例，異常率為1.99%，主要表現(xiàn)為頸部透明帶（nuchal translucency，NT）或頸部褶皺（nuchal fold，NF）增厚、鼻骨不清、雙腎盂分離、單臍動(dòng)脈、心臟室間隔膜缺失、臍膨出、羊水偏少、胎兒生長(zhǎng)受限、胎率低、胎兒偏小等，數(shù)據(jù)見表1。

2.2 NIPT檢測(cè)結(jié)果

1 207例臨床標(biāo)本中經(jīng)基因測(cè)序檢出高風(fēng)險(xiǎn)樣本共20例，異常率為1.66%（20/1 207），其中T21高風(fēng)險(xiǎn) 8例（0.66%，8/1 207），T18高風(fēng)險(xiǎn) 7例（0.58%，7/1 207），21?單體或缺失高風(fēng)險(xiǎn) 3例，18?單體或缺失高風(fēng)險(xiǎn)1例和13?單體或缺失高風(fēng)險(xiǎn)1例。20例高風(fēng)險(xiǎn)病例經(jīng)染色體核型分析確診異常的有12例，其中高齡孕婦10例，占83.33%，見表2。

2.2.1 T21檢測(cè)結(jié)果

8例高風(fēng)險(xiǎn)病例行羊水穿刺染色體核型分析，結(jié)果顯示7例為T21核型，1例為正常核型，結(jié)果見表3。

NIPT檢測(cè)T21的靈敏度為100%（7/7）、特異度為 99.92%（1 199/1 200）、漏診率為 0（0/7）、誤診率為0.08%（1/1 200）、診斷準(zhǔn)確度為99.92%（1 206/1 207）、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為87.5%（7/8）、陰性預(yù)測(cè)值為100%（1 199/1 199）。

表1 1 207例入選NIPT的孕婦信息Table 1 Basic characteristics of the 1 207 pregnant women of NIPT

表2 20例NIPT陽(yáng)性病歷資料Table 2 Details of the 20 NIPT positive cases

8例T21高風(fēng)險(xiǎn)的樣本Z值范圍為4.029～9.858，平均 Z 值為 6.710±2.122，95%置信區(qū)間（95%confidence interval，95%CI）為 4.936～8.484。

表3 T21的NIPT與染色體核型分析結(jié)果比較Table 3 Comparison results of NIPT for T21 and karyotype analysis

2.2.2 T18檢測(cè)結(jié)果

7例高風(fēng)險(xiǎn)病例經(jīng)羊水穿刺染色體核型分析確證T18核型5例，正常核型2例，結(jié)果見表4。

NIPT檢測(cè)T18的靈敏度為100%（5/5）、特異度為 99.83%（1 200/1 202）、漏診率為 0（0/5）、誤診率為0.17%（2/1 202）、診斷準(zhǔn)確度為99.83%（1 205/1 207）、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為71.43%（5/7）、陰性預(yù)測(cè)值為100%（1 200/1 200）。

表4 T18的NIPT與染色體核型分析結(jié)果比較Table 4 Comparison results of NIPT for T18 and karyotype analysis

7例T18高風(fēng)險(xiǎn)的樣本Z值范圍為3.437～9.368，平均 Z 值為 6.593±2.352，95%CI為 4.418～8.768。

2.2.3 單體或缺失疾病檢測(cè)結(jié)果

5例染色體單體或缺失病例經(jīng)染色體核型分析均為正常核型。

2.2.4 臨界風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果

使用高通量基因測(cè)序技術(shù)對(duì)1 207例臨床標(biāo)本進(jìn)行NIPT檢測(cè)，有30例標(biāo)本|Z|值處于臨界風(fēng)險(xiǎn)，結(jié)果見表5。30例標(biāo)本經(jīng)復(fù)查，結(jié)果全為低風(fēng)險(xiǎn)。

30例臨界風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)本初查|Z|值范圍為3.014～4.407，平均|Z|值為 3.360±0.378；復(fù)查|Z|值范圍為0.069～2.997，平均|Z|值為 1.404±0.803；兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，t=12.052，P＜0.05，可認(rèn)為兩組結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 30例臨界陽(yáng)性標(biāo)本復(fù)查結(jié)果Table 5 Review results of 30 critical positive specimens

3 討論

NIPT是近年來興起的一種新型檢測(cè)手段，主要針對(duì)21、18和13號(hào)染色體進(jìn)行檢測(cè)。關(guān)于NIPT對(duì)胎兒染色體非整倍體異常的診斷效能評(píng)價(jià)，Yao、Norton 和張玢等［5?7］報(bào)道 NIPT 對(duì) T21的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值可達(dá)90%以上，Wang等［8］報(bào)道NIPT對(duì)T18的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為64%。Zhang等［9］的研究認(rèn)為NIPT對(duì)T21、T18和T13的檢測(cè)靈敏度分別為99.17%、98.24%和100%，特異度分別為99.95%、99.95%和99.96%。Qiang等［10］的研究顯示NIPT對(duì)T21和T18的檢測(cè)靈敏度分別為100%和100%，特異度分別為100%和99.86%。本文研究結(jié)果與Qiang等的研究結(jié)果類似。胎兒T13的發(fā)病率低，約為 1∶25 000［11］，本文研究標(biāo)本數(shù)量有限，因此關(guān)于T13篩查的臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)有待進(jìn)一步積累。

美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（the Ameri?can College of Medical Genetics and Genomics，AC?MG）指南建議，對(duì)于不同年齡階段非肥胖的孕婦，在孕9～10周后可選擇無創(chuàng)產(chǎn)前篩查（non?invasive prenatal screening，NIPS）來替代傳統(tǒng)的血清學(xué)篩查進(jìn)行 T21、T18和 T13的篩查［12］。在我國(guó)，現(xiàn)階段NIPT的檢測(cè)成本較為昂貴，且具有資質(zhì)的檢測(cè)機(jī)構(gòu)有限，所以暫未被列為常規(guī)產(chǎn)前篩查項(xiàng)目，無法在適用人群中大面積普及和推廣，因此臨床產(chǎn)前篩查策略傾向于序貫檢查。隨著生活水平的提高和優(yōu)生優(yōu)育意識(shí)的加強(qiáng)，孕婦依據(jù)其個(gè)人目標(biāo)與意愿選擇診斷性或者篩查性技術(shù)的比例日益增大。一些血清學(xué)篩查低風(fēng)險(xiǎn)的孕婦因擔(dān)心漏診而進(jìn)一步選擇NIPT，也有部分經(jīng)濟(jì)條件較好的孕婦放棄血清學(xué)篩查直接行 NIPT［13］。

雖然NIPT被認(rèn)為是一種精準(zhǔn)的產(chǎn)前篩查，但不可否認(rèn)NIPT存在檢測(cè)假陽(yáng)性和假陰性的問題，盡管發(fā)生概率極低，所以不能稱之為診斷，更不能取代有創(chuàng)的羊水或胎盤絨毛膜穿刺［14］。段紅蕾等［13］的研究顯示，NIPT報(bào)告高風(fēng)險(xiǎn)者中，部分胎兒染色體核型分析未見異常，即NIPT存在部分假陽(yáng)性結(jié)果。本研究20例高風(fēng)險(xiǎn)孕婦中有8例胎兒染色體核型分析正常，也說明了存在假陽(yáng)性問題。引起假陽(yáng)性的主要原因有母體基因組中拷貝數(shù)變異、限制性胎盤嵌合、母體染色體嵌合、雙胎中一胎停育、母體存在惡性腫瘤［15］。因此，臨床中須強(qiáng)調(diào)NIPT高風(fēng)險(xiǎn)不能作為引產(chǎn)指征，必須通過染色體核型分析確診。

在20例NIPT高風(fēng)險(xiǎn)病例中，經(jīng)染色體核型分析確診異常的有12例，其中高齡孕婦10例，占83.33%，表明高齡是發(fā)生胎兒非整倍體疾病的一個(gè)重要危險(xiǎn)因素。

有研究認(rèn)為超聲顯示胎兒結(jié)構(gòu)異常者，染色體異常發(fā)生率為10.1%，但其中T21、T18和T13合計(jì)僅占染色體異常的64.4%，其余約1/3的染色體異常不在NIPT的檢測(cè)范圍內(nèi)［16］。本文24例B超顯示胎兒結(jié)構(gòu)異常者的NIPT結(jié)果均為低風(fēng)險(xiǎn)；12例確診胎兒染色體整倍體畸形者的B超結(jié)果均為正常。提示B超結(jié)果與NIPT結(jié)果不相平行，兩種篩查方法不可相互替代。B超對(duì)于胎兒非整倍體疾病的檢出能力有限，對(duì)于結(jié)果正常者也應(yīng)根據(jù)孕婦的其他危險(xiǎn)因素酌情選擇NIPT。而NIPT低風(fēng)險(xiǎn)人群并不能完全排除異常妊娠［17?18］，而仍需利用B超及時(shí)發(fā)現(xiàn)先天性心臟病、畸形兒等異常。

本研究中有30例標(biāo)本初查結(jié)果為臨界風(fēng)險(xiǎn)，經(jīng)相同方法復(fù)查，均為低風(fēng)險(xiǎn)。兩次的結(jié)果存在明顯差異，原因可能為測(cè)序和數(shù)據(jù)分析存在隨機(jī)誤差。30例對(duì)象經(jīng)隨訪自述結(jié)果均無異常。這提示NIPT在診斷臨界值處的結(jié)果重現(xiàn)性欠佳。實(shí)驗(yàn)室對(duì)于臨界風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果的分析和判斷應(yīng)謹(jǐn)慎。研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)胎兒發(fā)生非整倍體疾病時(shí)，平均Z值會(huì)超過診斷閾值的2倍以上，若以95%CI判斷，可提高診斷的準(zhǔn)確度。另外，本研究從1 207例臨床標(biāo)本中檢出21、18和13單體或缺失高風(fēng)險(xiǎn)5例。5例經(jīng)染色體核型分析均為正常核型。提示NIPT在21、18和13單體或缺失疾病中的應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，與傳統(tǒng)篩查方法相比，NIPT具有靈敏度高、特異性佳、漏診率低的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)檢測(cè)通量高、周期短，安全無創(chuàng)，可避免穿刺取樣術(shù)帶來的胎兒丟失、宮內(nèi)感染等風(fēng)險(xiǎn)，是一種更加精確的胎兒染色體非整倍體產(chǎn)前篩查技術(shù)，是對(duì)現(xiàn)有出生缺陷三級(jí)預(yù)防體系的有效補(bǔ)充和完善。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展與更新，NIPT在臨床的應(yīng)用將會(huì)更加廣泛。

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