miR-21在脂多糖誘導人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細胞炎癥反應中的變化及其作用

王平軍，曾其毅

(南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院，廣州 510282)

膿毒癥是感染導致的全身性炎癥反應，可導致膿毒癥急性腎損傷[1～3]。膿毒癥急性腎損傷病情嚴重，病死率為40%～60%[4]。脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌細胞膜的組成成分，常作為外來毒素建立膿毒癥急性腎損傷模型[5]。研究表明，細胞凋亡與炎癥反應共同導致了膿毒癥急性腎損傷[1,6,7]。miRNA是一種內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，通過降解mRNA或抑制mRNA翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平負性調(diào)節(jié)基因表達[8～10]。miR-21是一種抗凋亡因子，其抗凋亡作用或參與膿毒癥急性腎損傷[1～6]。但miR-21與LPS誘導的人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細胞炎癥反應的關系鮮見報道。2017年3月～2018年2月，本研究觀察了LPS誘導人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細胞炎癥反應后miR-21的表達變化，旨在探討miR-21在膿毒癥急性腎損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 HK-2細胞，中國典型培養(yǎng)物保藏中心細胞庫；PBS、MEM培養(yǎng)基、NEAA，廣州一科生物科技有限公司；FBS、青-鏈霉素雙抗、DMSO，美國Gibco公司；LPS，美國Sigma公司。TRIzol RNAiso,日本TaKaRa公司；mRNA及miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，南京諾維贊生物科技有限公司；定量PCR試劑盒，北京百泰克生物技術有限公司；全蛋白提取試劑盒，江蘇凱基生物技術股份有限公司；IL-6一抗，沈陽萬類生物科技有限公司；GAPDH一抗，美國Bioworld公司；Lipofectamine3000美國Life Technologies公司；兔IgG二抗，南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院。

1.2 細胞培養(yǎng)、分組及處理 將細胞接種于含10% FBS、1%青-鏈霉素雙抗、1% NEAA的MEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞融合80%～90%時傳代，傳代次日更換新的培養(yǎng)基，之后每2～3天更換培養(yǎng)基1次。對照組和LPS組：對照組以等量PBS處理，LPS組以終濃度10 μg/mL LPS誘導4、8、12 h。轉(zhuǎn)染miR-21 mimics (50 nmol) 24 h組或NC mimics (50 nmol) 24 h組(即轉(zhuǎn)染陰性對照物組)：轉(zhuǎn)染miR-21 mimics或NC mimics的HK-2細胞，先采用基本培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，然后再用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。轉(zhuǎn)染miR-21 mimics (50 nmol)24 h+LPS處理組和轉(zhuǎn)染陰性對照處理1組：轉(zhuǎn)染miR-21 mimics或NC mimics (50 nmol) 24 h后再給予10 μg/mL LPS誘導8 h。轉(zhuǎn)染miR-21 mimics(100 nmol)24 h +LPS處理組和轉(zhuǎn)染陰性對照處理2組：轉(zhuǎn)染miR-21 mimics或NC mimics 24 h后再給予10 μg/mL的LPS誘導12或24 h。

1.3 IL-6 mRNA及miR-21表達檢測 采用RT-qPCR法。總RNA提?。篢RIzol法提取總RNA，經(jīng)紫外分光光度計鑒定，提取的總RNA濃度和純度合格。逆轉(zhuǎn)錄及擴增引物：采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和特異性miRNA莖環(huán)引物進行miR-21的逆轉(zhuǎn)錄，實時熒光定量PCR試劑盒進行實時熒光定量。逆轉(zhuǎn)錄反應條件：25 ℃ 5 min、50 ℃ 15 min、85 ℃ 2 min。將逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA加入40 μL DEPC水稀釋5倍，- 20 ℃保存。PCR擴增反應條件：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性15 s、60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s共40～50個循環(huán)。IL-6逆轉(zhuǎn)錄反應條件：25 ℃ 5 min、50 ℃ 15 min、85 ℃ 2 min。將逆轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA加入40 μL DEPC水稀釋5倍，- 20 ℃保存。PCR擴增反應條件：94 ℃預變性 2 min，94 ℃變性15 s、60 ℃退火 15 s、72 ℃延伸30 s共40～50個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。將對照細胞目的基因相對表達量設為1，計算其他各組目的基因相對表達量。

1.4 IL-6蛋白表達檢測 采用Western blotting法。培養(yǎng)的細胞貼壁后，吸棄完全培養(yǎng)基，加入1 mL冷的PBS沖洗2次，每次振搖數(shù)次，盡量去除培養(yǎng)基；在每毫升預冷的Lysis Buffer中加入10 μL磷酸酶抑制劑、1 μL蛋白酶抑制劑和5 μL PMSF，混勻。每培養(yǎng)皿或6孔板所需的Lysis Buffer體積為50～100 μL，然后按樣品個數(shù)計算所需的Lysis Buffer總體積，冰上保存待用。在每培養(yǎng)皿或6孔板加入等體積的Lysis Buffer，然后用刷子刮下培養(yǎng)皿或6孔板中的貼壁細胞，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中。將所有樣品置于4 ℃搖床平臺，劇烈振蕩30 s，冰上放置4 min，重復5次。4 ℃ 12 000 g離心5 min，上清即為提取的細胞總蛋白，- 80 ℃保存。采用Bradford法進行蛋白定量。將96孔板置于振蕩器上震蕩20 s，排除氣泡，放置2 min，酶標儀于595 nm波長處檢測各孔的吸光度值，以蛋白含量(μg)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。蛋白樣品1 μL+去離子水4 μL(即為5倍稀釋)，加入考馬斯亮藍G250溶液195 μL，震蕩混勻，放置2 min，酶標儀于595 nm波長處檢測各孔的吸光度值，根據(jù)標準曲線得到相應的蛋白含量。蛋白變性及分裝保存：5× SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液loading buffer 要先振蕩離心，吸液時槍頭垂直液面緩慢吸出，避免觸及管壁。按每4 μL蛋白樣品中加入1 μL 5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，振蕩混勻，管口覆蓋封口膜，沸水加熱5 min，使蛋白充分變性。蛋白條帶獲?。合扰淠z，然后電泳(上樣量為60 μg)，再轉(zhuǎn)膜(將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜)，BSA封閉1.5 h，洗膜3次，一抗封閉過夜，次日洗膜3次后二抗避光封閉1 h，避光洗膜3次，最后用Odyssey雙色紅外熒光掃描成像系統(tǒng)獲得圖片。用Image J軟件分析各蛋白電泳條帶灰度值，以目的蛋白電泳條帶灰度值與內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值的比值作為目的蛋白相對表達量。將對照細胞目的蛋白相對表達量設為1，計算其他各組目的蛋白相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 LPS對HK-2細胞IL-6 mRNA及蛋白表達的影響 LPS組LPS誘導4、8、12 h IL-6 mRNA相對表達量分別為12.82±0.34、3.01±0.49、2.61±0.51，均較對照組明顯升高(P均<0.05)。在4 h時IL-6升高達到峰值，隨后迅速下降。LPS組LPS誘導4、8、12 h IL-6蛋白相對表達量分別為3.13±0.33、2.79±0.51、2.69±0.21，均較對照組明顯升高(P均<0.05)。

2.2 LPS對HK-2細胞miR-21表達的影響 LPS組LPS誘導4、8、12 h miR-21相對表達量分別為0.71±0.07、0.73±0.03、0.68±0.08，均較對照組明顯下降(P均<0.05)。

2.3 過表達miR-21對LPS誘導HK-2細胞IL-6 mRNA表達的影響 轉(zhuǎn)染miR-21 mimics (50 nmol) 24 h組miR-21相對表達量為17.07±1.40，較轉(zhuǎn)染陰性對照物組表達明顯升高(P<0.01)，說明轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染miR-21 mimics (50 nmol) 24 h+LPS處理組IL-6 mRNA相對表達量為0.68±0.07，較轉(zhuǎn)染陰性對照處理1組明顯降低(P<0.05)。

2.4 過表達miR-21對LPS誘導HK-2細胞IL-6蛋白表達的影響 轉(zhuǎn)染miR-21 mimics (100 nmol) 24 h+LPS處理組LPS誘導12 h miR-21相對表達量為6.85±1.77，較轉(zhuǎn)染陰性對照處理2組表達明顯升高(P<0.05)，說明轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染miR-21 mimics (100 nmol) 24 h+LPS處理組LPS誘導24 h IL-6蛋白相對表達量為0.52±0.15，較轉(zhuǎn)染陰性對照處理2組表達明顯降低(P<0.01)。

3 討論

在HK-2細胞膿毒癥急性腎損傷細胞模型中，以往文獻一般以0、4、8、12 h作為時間點，以0、1、5、10 μg/mL作為LPS的誘導濃度，最后選用5 μg/mL LPS誘導8 h來建立模型[5,11]。本實驗選擇10 μg/mL作為LPS誘導濃度，誘導時間分別為0、4、8、12 h。本研究結(jié)果顯示，在LPS誘導HK-2細胞4、8、12 h后，與對照組比較(等量PBS處理12 h)，IL-6 mRNA和蛋白相對表達量均明顯升高，與以往文獻[5]報道一致，表明本實驗建立的膿毒癥急性腎損傷細胞模型是成功的。越來越多研究表明，miRNA在膿毒癥或膿毒癥急性腎損傷中具有重要作用，如miR-21[1,3,6,10]、miR-375[2]、miR-210[12]、miR-107[13]、miR-23b[14]、miR-146a[15,16]、miR-132[17]。以往研究證實，膿毒癥時miR-21表達上升[18]，急性腎損傷時miR-21表達亦上升[19]。然而，在膿毒癥急性腎損傷時miR-21表達變化鮮見報道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-21在膿毒癥急性腎損傷HK-2細胞中的表達明顯下降，表明miR-21可能參與膿毒癥急性腎損傷中的炎癥反應過程。

miRNA幾乎參與每個細胞過程，可調(diào)節(jié)人類大約1/3的基因[6]，是腫瘤與炎癥反應中重要的調(diào)節(jié)者[2]。miR-21被發(fā)現(xiàn)在所有腫瘤中表達上升[20,21]，可作為腫瘤的生物學標志物[22～24]。另外一些研究則關注miR-21在腫瘤中的作用[25,26]。miR-21在許多疾病發(fā)生、發(fā)展過程中是一種強力的抗凋亡因子。在膿毒癥急性腎損傷研究中，miR-21的抗凋亡作用亦參與其中[1,6]。有研究顯示，miRNA與膿毒癥的調(diào)節(jié)相關，具有抗炎或促炎作用。在膿毒癥或其他炎癥反應中，促炎的miRNA有miR-155[27,28]、miR-375[2]，抗炎的miRNA有miR-21[10,29～31]、miR-210[11]、miR-146a[15]。以往研究證實，miR-21與炎癥反應有關[29,30,32]，但鮮有研究關注miR-21與膿毒癥急性腎損傷的關系[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達miR-21能夠降低LPS誘導的HK-2細胞IL-6 mRNA和蛋白表達。表明miR-21在膿毒癥急性腎損傷中可能具有抗炎作用，與以往研究[10,29,30]基本一致。

總之，IL-6在LPS誘導的HK-2細胞中表達升高、miR-21表達降低。過表達miR-21能夠降低LPS誘導的HK-2細胞IL-6 mRNA和蛋白表達，證實miR-21在膿毒癥急性腎損傷中可能具有抗炎作用，有可能作為膿毒癥急性腎損傷治療的新靶點。