白酒香氣物質研究的方法學

范文來， 徐 巖

(江南大學 生物工程學院 釀造微生物學及應用酶學研究室， 江蘇 無錫 214122)

我國白酒風味物質研究始于1964年茅臺酒的第2次試點。 1964年10月采用紙上層析法研究醬香型白酒窖底香氣微量成分，當時一個斑點呈現窖底香，經鑒定是己酸乙酯，并進行了添加實驗確認[1-2]。1955年第一臺商業(yè)化氣相色譜(gas chromatography，GC)出現[3]，1967年將GC應用于我國白酒微量成分研究[4]。1964年Fuller等[5]發(fā)明了氣相色譜-聞香技術(GC-olfactometry)，將GC的化合物分離性能與人的鼻子聞香結合起來，從此，食品風味研究取得了突飛猛進的發(fā)展。但直到2005年GC-O技術才應用于我國白酒風味研究[6]。筆者曾經對風味研究方法及香氣物質研究有過回顧[4, 7-10]，本文擬回顧GC-O技術應用于白酒研究的方法學，包括總體研究思路、聞香技術、香氣成分定量技術以及香氣重組與缺失技術，以期對酒類香氣成分研究有所啟發(fā)。

1 白酒香氣總體研究思路

白酒香氣研究的方法與食品風味研究方法[11-12]類似，但又有其自身特點。主要包括以下幾個主要方面。

一是香氣物質提取。香氣物質提取方法目前主要使用的還是經典的液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)方法，白酒中大部分香氣物質是極性較強的化合物，因而常用萃取劑是乙醚、二氯甲烷、氟利昂或它們的混合物[13-21]，當然也有使用頂空固相微萃取(head-space solid phase microextraction，HS-SPME)作為樣品提取的方法[6]，但由于該方法在萃取物極性方面上的局限，因而較少使用。

白酒LLE的關鍵是酒精對萃取物的影響。研究表明，高度白酒必須稀釋后才能有效萃取，稀釋后的酒精度是10%vol～14%vol[6,13-14,18]。

為防止水可能帶入的氣味物，風味研究全過程使用的水為超純水(Milli-Q)，且將水加熱煮沸5 min，冷卻后使用。

為防止洗滌劑帶入的氣味物，必須使用無味洗滌劑浸泡實驗用玻璃器皿1～2d，再按常規(guī)方法清洗。清洗后的玻璃器皿再用煮沸冷卻后的超純水洗滌3次，進行烘干，不能高溫烘干的材料，常溫晾干。

二是香氣物質分離。白酒微量成分含量十分豐富，多達千種[22-23]，已經鑒定出的化合物達698種[23-24]。在聞香過程中，可能會出現化合物GC峰重疊，造成香氣重疊；或某些化合物香氣太強，而掩蓋了香氣較弱的化合物。因此，通常會將萃取后的有機相再進行分離，或稱為分餾(fractionation)。如將萃取后的有機相分為酸性組分(acidic fraction，AF)、堿性組分(basic fraction，BF)、水溶性組分(water-soluble fraction，WSF)和中性組分(neutral fraction，NF)[17-18]，或分為AF、WSF、中堿性組分(N/BF)[16,21]，或分為酸性-水溶性組分(A/WF)和N/BF[13-14,19-20,25-27]。但由于中性組分或中堿性組分仍然比較復雜，即化合物眾多，此時，還可以采用正相色譜技術(normal-phase liquid chromatography，NPLC)，根據化合物極性將其再細分為多個亞組分(subfraction)[13,18]。如在洋河大曲研究時，N/BF組分化合物多，采用硅膠60(silica gel 60)吸附N/BF組分香氣成分，分別使用V(戊烷)∶V(乙醚)=98∶2、95∶5、90∶10和0∶100混合液洗脫成4個組分[13]。在進行茅臺酒和郎酒研究時，分別使用V(戊烷)∶V(乙醚)=100∶0、95∶5、90∶10、80∶20、70∶30和0∶100混合液洗脫成6個組分[18]。在研究藥香型白酒香氣和萜烯類化合物時，將N/BF組分使用硅膠柱分別用V(戊烷)∶V(乙醚)=100∶0、95∶5、90∶10、80∶20、70∶30、50∶50和0∶100混合液洗脫出7個組分[19,28]。如此形成的AF或A/WF、BF、NF或N/BF、水溶性組分，或者加上NPLC的亞組分分別進行聞香。

三是活性香氣化合物(active-aroma compounds)發(fā)現。一個特定酒樣中，什么技術可以檢測哪一個化合物對香氣有貢獻呢？通常認為是GC-O技術[5]，又分為精靈分析(CharmAnalysis)法[29]、香氣萃取稀釋分析(aroma extract dilution analysis，AEDA)法[12,30]、香氣萃取濃縮分析(aroma extract concentration analysis，AECA)法[31]、Osme技術(Osme techniques)[32]等。這些技術能檢測到可能呈香的化合物，再與GC-氫火焰離子化檢測器(GC-flame ionization detector，GC-FID)或GC-質譜檢測器(GC-mass spectrometry，GC-MS)技術結合后，就可以進行香氣化合物鑒定。

香氣化合物的鑒定需要使用標準品進行確認，即當未知化合物香氣特征、色譜保留時間(retention index，RI)[33]以及質譜信息與標準品完全一致時，即可確認。通常情況下，需要使用二個極性不同的色譜柱(如極性和非極性色譜柱)進行確認[13-14,34-35]。

四是重要活性香氣化合物確認。應用Charm-Analysis、AEDA和Osme技術能夠發(fā)現最重要的風味化合物，但由于檢測到的這些化合物呈現的是在空氣中的香氣強度，與原白酒樣品中實際香氣強度有區(qū)別，因此，通常使用氣味活力值(odor activity value，OAV)的大小來表征其重要程度。OAV是指氣味化合物濃度與其對應介質中氣味閾值的比值[12,36]。OAV越大，說明該香氣化合物越重要[37-39]。化合物濃度的測定在本文第3節(jié)香氣成分定量技術部分討論。

為此，需要測定這些香氣化合物在白酒中的氣味閾值。首次大規(guī)模測定白酒香氣化合物閾值文章發(fā)表于2011年，當時組織國家級評酒員測定了79個香氣化合物在φ=46%酒精水溶液中的氣味閾值[40]，其后，不少研究人員又陸續(xù)測定了一些化合物的閾值。到目前為止，據不完全統(tǒng)計共測定了143種化合物氣味閾值，包括32種酯類、15種醇類、15種醛類、2種縮醛、5種酮類、14種脂肪酸、9種吡嗪、7種呋喃類、16種芳香族、14種酚類、4種內酯、6種含硫化合物和4種萜烯類化合物的閾值[25, 35, 40-43]。

五是關鍵香氣化合物確認。OAV最大的化合物是不是關鍵香氣需要進行驗證。其一是選擇一些OAV較高的化合物，進行香氣重組(recombination)或香氣重構(reconstitution)，建立香氣模型。如果重組后的整體香氣與原有酒樣不一樣，或相似度不高，則需要從香氣物質提取開始重新實驗；其二是通過缺失實驗(omission test)，確定關鍵風味成分。如果缺失某個化合物后，整體香氣與原有研究酒的香氣不同，則該化合物為關鍵香氣化合物[34-35, 44]。

2 聞香技術

無論采用何種聞香技術，參加聞香的人員必須進行培訓與選擇[6,34]。AEDA聞香時通常需要2～3人，每個稀釋度聞香6次(每人2～3次)，只要有1人聞到香氣就認可這個香氣存在，計算其香氣稀釋因子(flavor dilution factor，FD值)[14,34-35]。而Osme技術中，主要使用香氣強度。香氣強度通常有6點刻度法(0～5)[45]和16點刻度法(0～15)[13]?！?”表示沒有香氣；中間點“3”或“8”表示香氣強度中等；“5”或“15”表示香氣最強[13,45]。

2.1 AEDA法

AEDA方法由Grosch于1993年發(fā)明[12,30]。萃取濃縮后的樣品與溶劑按V∶V=1∶1、1∶2、1∶3比例稀釋，每一個稀釋樣品用GC-O聞香[11]，結果用FD值表示。FD值是指最初萃取物中呈香物質濃度與該香味物質最稀時(GC-O仍能檢測到)濃度比。因此，FD值是一個相對測量值，是化合物在空氣中的OAV值。AEDA法已經在酒類風味研究領域得到廣泛應用，如豉香型白酒香氣研究[34]、洋河大曲新酒與老酒香氣研究[6]、五糧液與劍南春香氣研究[14]、清香型原酒香氣研究[20]。

2.2 Osme技術

Osme一詞來源于希臘語，意思為“聞香(smell)”。Osme技術由McDaniel等人開發(fā)[32]。該方法是萃取獲得的樣品，不經稀釋，直接進行GC-O分析，記錄香氣強度。將感官品嘗人員記錄到的香氣強度進行平均，即為香氣強度值，此法又稱為GC-香氣強度法(GC-intensity)。Osme技術考慮了斯蒂文斯法則(Stevens’s Law)[3]，它測量的是香氣物質的時間-強度值(time-intensity)。該技術因耗時短，已經在白酒香氣研究中獲得廣泛應用，如洋河大曲香氣研究[13]、洋河綿柔型白酒香氣研究[27]、清香型白酒(包括汾酒、寶豐酒和青稞酒)香氣研究[35]、茅臺與郎酒香氣研究[18]、醬香型習酒和濃香型習酒香氣研究[25, 46]、老白干香型白酒香氣研究[16]、牛欄山二鍋頭香氣研究[26]、寶豐酒香氣研究[47]、藥香型董酒香氣研究[19]、豉香型白酒香氣研究[48]、兼香型白酒香氣研究[17]、白酒異嗅物研究[21]。

3 香氣成分定量技術

精確定量白酒中香氣成分是件十分困難的事。白酒中香氣成分眾多，化學性質不一；濃度千差萬別，從ng/L至g/L。因此，對白酒化合物定量通常需要幾個方法結合使用。對濃度較高的化合物，如己酸乙酯(濃香型等香型)、乙酸乙酯、乳酸乙酯等(幾百mg/L至g/L)，通常采用直接進樣GC-FID測定[25]；而對于濃度較低的化合物(μg/L至幾十mg/L)，通常采用HS-SPME[25]或攪拌子吸附萃取技術(stir bar sorptive extraction，SBSE)測定[49]。而對于一些特殊化合物如含氮化合物，則采用專用檢測器氮磷檢測器(NPD)測定[50]；另外一些化合物如反-2-烯醛類化合物需要衍生化后測定[34]。

3.1 直接進樣GC-FID

白酒中一些高濃度香氣化合物可以采用此法測定，主要包括濃香型和醬香型白酒中的乙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、正丙醇、正丁醇、2-甲基丙醇(異丁醇)、3-甲基丁醇(異戊醇)[25]；清香型白酒中的乙酸乙酯、乳酸乙酯[35]；豉香型白酒中的乙酸乙酯、乳酸乙酯、正丙醇、異丁醇、異戊醇和2-苯乙醇[34]；芝麻香型白酒中的乙酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、庚酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇和乙縮醛[39]。因測定的化合物大部分為酯類，故采用乙酸戊酯作內標[25,34-35]。該法還可以直接定量白酒中的乙醛與乙縮醛，此時使用辛醛-d16作內標[51]。

另外一些化合物也可以采用GC-FID檢測，如乙醛和乙縮醛，此時可用辛醛-d16作內標[51]。

3.2 LLE和液液微萃取

LLE與GC-MS結合后可用于化合物定量分析，如地衣芽孢桿菌發(fā)酵液成分檢測[52]，高濃度硫化物檢測等[53]。

液液微萃取(liquid-liquid microextraction，LLME)是一種環(huán)境友好的技術[54]。LLME結合GC-MS采用選擇離子法(selective ion monitoring，SIM)通常定量mg/L級化合物[25, 55]。該法在醬香型白酒中可一次性定量48種香氣化合物，包括酯類13種、醇類11種、酸類9種、芳香族化合物9種、呋喃類化合物4種、醛酮類1種以及吡嗪類化合物1種。乙酸乙酯、乙縮醛、丙酸乙酯因溶劑延遲無法定性與定量；乙醛因揮發(fā)性太強，無法使用LLME方法定量[55]。該法目前已經廣泛應用于白酒定量中，如醬香型[25,55]、濃香型[25]、清香型[35]、芝麻香型[56]白酒。另外，因SPME萃取頭對脂肪酸不敏感，故脂肪酸類化合物可以采用LLME法測定[39]。

3.3 SPME結合GC-MS

SPME技術于1989年由Belardi和Pawliszyn[57]開發(fā)，已經被廣泛用于食品風味物質研究[58]，主要用于定量μg/L級化合物。該技術可用于以下分析：一種是頂空分析，即HS-SPME，2005年HS-SPME首次應用于白酒風味研究[6]，后該技術結合GC-MS在我國白酒風味研究中獲得廣泛應用，如醬香型[18,25]、濃香型[25]、豉香型[34]、芝麻香型[39,59]白酒風味研究；白酒中異嗅物分析[21,60]。

另外一種是浸入式SPME技術(direct immersion-SPME，DI-SPME)。2007年DI-SPME技術應用于我國白酒風味成分定量[61]，后又應用于白酒中異嗅化合物[62]、游離揮發(fā)性酚類[63]以及揮發(fā)性香氣物質[64]定量。

3.4 SBSE結合GC-MS

SBSE技術由比利時色譜研究所Baltussen和Sandra等[65-66]于1999年開發(fā)，與其類似的技術攪拌子頂空吸附萃取技術(headspace sorptive extraction，HSSE)則由Bicchi和Tienpont等[67-68]首先應用。SBSE技術已經廣泛應用于食品分析中[69-73]。2011年，這一技術被用于醬香型茅臺與郎酒的香氣成分分析[49]，一次可以定量76個揮發(fā)性成分，包括25種酯、10種醇、9種醛和酮、8種芳香族、5種呋喃、3種含氮化合物、6種脂肪酸、4種酚類、3種萜烯、1種含硫化合物、1種內酯和1種縮醛。

3.5 固相萃取結合GC-MS

固相萃取(solid phase extraction，SPE)己被公認為是一個非常有用的樣品預處理技術，已經廣泛應用于飲料酒成分分析中，如葡萄酒、威士忌、白蘭地[74]以及結合態(tài)風味化合物[75-76]研究中。SPE可以用于白酒香氣成分預處理，即選擇某一吸附材料，吸附白酒香氣物質，再洗脫、濃縮后用于GC-O分析[77]；SPE結合GC-MS技術可以定量白酒中香氣物質如定量8種內酯[78]，包括γ-丁內酯、γ-戊內酯、γ-己內酯、γ-庚內酯、γ-辛內酯、γ-壬內酯、γ-癸內酯、γ-十二內酯；或定量白酒中其他風味物質[79]。

3.6 專用檢測器測定技術

白酒中含氮、硫化合物，因FID或MS檢測器響應不靈敏，需要使用專用檢測器進行定性和定量。

氮磷檢測器(nitrogen-phosphorus detector，NPD)可用于檢測白酒中吡嗪類化合物[50]。NPD俗稱堿火焰離子化檢測器(alkali flame ionization detector，AFID)、熱離子離子化檢測器(thermionic ionization detector，TID)、火焰熱離子化檢測器(flame thermionic detector，FTD)、熱離子化專用檢測器(thermionic specific detector，TSD)，于1964年被Karmen和Giuffrida發(fā)明[80]。應用GC-NPD并結合GC-MS，可以定性白酒中26種吡嗪類化合物，在有標準品的情況下能用于定量分析[50]。

火焰光度檢測器(flame photometric detector，FPD)是在FID基礎上于1966年發(fā)明的[80]，目前已經發(fā)展成為脈沖火焰光度檢測器(pulsed flame photometric detector，PFPD)。GC-FPD/PFPD已經用于白酒硫化物檢測[59, 81-82]，如GC-FPD可以測定白酒中近20種硫化物[81]。GC-PFPD可以檢測茅臺酒中13種硫化物[82]。

3.7 衍生化測定技術

不飽和醛如反-2-烯醛和二烯醛是豉香型白酒重要香氣成分[34]，由于這些化合物含量低，常規(guī)方法無法檢測，因此，需要衍生化后進行檢測。使用O-(2,3,4,5,6-五氟苯)羥胺鹽酸鹽(O-(2,3,4,5,6-pentafluorobenzyl)hydroxylamine hydrochloride，PFBHA)作為衍生化試劑，p-氟苯甲醛作內標(p-fluorobenzaldehyde)，HS-SPME結合GC-MS同時萃取衍生化可測定反-2-戊、己、庚、辛、壬烯醛、反,反-2,4-己二烯醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反,反-2,4-辛二烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、反,順-2,6-壬二烯醛等[83]。

當然，由于羰基會與PFBHA反應，故該衍生化方法能定性白酒中53種羰基化合物，可定量除乙醛和丙酮外的51種羰基化合物，包括11種直鏈飽和脂肪醛、3種支鏈飽和脂肪醛、14種不飽和脂肪醛、8種飽和脂肪酮、6種芳香族羰基化合物、4種呋喃類羰基化合物以及5種其他羰基化合物[84-85]。與常規(guī) HS-SPME定量方法相比，多定量43種化合物，檢測限最低達到0.01 μg/L，即10 ng/L(反-2-庚烯醛)[85]。

3.8 全二維氣相色譜-飛行時間質譜技術

全二維氣相色譜-飛行時間質譜(comprehensive two-GC-time of flight-MS，GC×GC-TOF-MS)于1985年由Phillips等[86-87]發(fā)明。這一技術解決了一維GC不能將眾多化合物分離的問題。目前這一技術已經在白酒硫化物[88]、白酒風味成分[89]研究等方面得到應用。

4 香氣重組與缺失技術

定量了活性香氣化合物濃度，測定它們在φ=46%酒精水溶液中的嗅閾值，則可以計算出OAV值。將計算后的OAV值從大到小排序。在白酒香氣重組時，通常忽略OAV小于1的化合物，而使用OAV大于1的化合物進行香氣重組，如豉香型白酒香氣研究中，共檢測到56個活性香氣成分，但僅采用34個OAV大于1的化合物進行重組[34]；在清香型汾酒香氣研究中，共檢測到66個活性香氣成分，僅采用27個OAV大于1的化合物進行香氣重組[35]；在濃香型劍南春酒香氣研究中，共檢測到126個活性香氣成分[14]，后選取40個化合物進行香氣重組[44]。

當重組后的φ=46%酒精水溶液香氣與最初的樣品香氣相似時，即可認為香氣重組成功，此時，可進行缺失實驗。缺失實驗是將用于重組的化合物逐一省略，重組出少一個化合物的新樣品，并逐一進行聞香判別。當某一化合物缺失后，重組樣品的香氣與原酒樣差距大或有顯著性差異時，即可認為該化合物是關鍵香氣化合物[12]。

然而，由于白酒重組香氣成分較多，逐一缺失時，會造成工作量特別是聞香工作量太大。故通常選擇缺少一類化合物如酯類或醇類化合物。如果某類化合物缺失后，造成重組樣品香氣與原有酒樣香氣顯著不同，則在此類化合物中再逐一缺失[34-35,44]。

5 研究展望

目前，大部分香型白酒的活性香氣成分已經得到廣泛研究，但能夠香氣重組的香型并不多?；蛟S，在樣品預處理上仍然存在一些缺陷；或沒有提取或分離出應該提取或分離的香氣成分；或在GC-O階段，某個香氣組分的香氣被其它成分所掩蓋；或者這個香氣成分處于聞香的后段，即化合物的RI值較高，且化合物不出峰，造成無法鑒定；或者這個香型的關鍵香氣是幾種香氣化合物協(xié)同作用的結果。要解決這些問題，需要開發(fā)一些新的研究策略來研究這些白酒的活性香氣成分。但不管如何，最后仍然需要定量、閾值測定、計算OAV，并進行香氣重組與缺失試驗。

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