3種槭屬植物花粉離體萌發(fā)適宜條件及活力檢測方法

康德星，王曉禹，梅 梅 ，張曉林，陸秀君

(沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧 沈陽 110866)

我國擁有槭樹種類約151種，因其樹冠較大，葉形態(tài)獨特，葉色多而密，近幾年來作為彩葉景觀樹種在園林綠化中被廣泛應(yīng)用。槭屬目前主要分布于北溫帶，我國作為槭樹植物的主要產(chǎn)地，擁有的槭屬植物資源十分豐富，這為槭屬植物作為園林綠化樹種在我國廣泛應(yīng)用提供了基礎(chǔ)[1]。

花粉是植物有性途徑進行遺傳物質(zhì)傳遞的載體，也是開展人工授粉及新品種培育最基本的材料?；ǚ刍盍﹄s交育種是否成功影響重大，花粉生活力的測定是保證花粉質(zhì)量的重要途徑，對花粉貯藏有著十分重要的意義[2]。

本研究采用離體萌發(fā)法、TTC染色法、I2-IK染色法、亞甲基藍染色法以及過氧化酶染色法[3]，對3種槭屬植物的新鮮花粉進行了較為系統(tǒng)的研究，找出了最佳培養(yǎng)條件、貯藏條件以及最佳染色方法，為日后不同槭樹品種之間進行授粉，克服花期不遇等提供一定的理論依據(jù)，并為今后開展槭屬植物雜交育種研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗材料于2016年4—6月取自沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)校園內(nèi)和苗木基地槭樹科3個種的花枝，分別是紅花槭(AcerrubrumL.)、元寶楓 (A.truncatumBunge)、糖槭(A.saccharumMarsh.)。

1.2 花粉收集方法

于槭屬植物形成花蕾時開始觀察，選取正常生長的植物進行觀測，待花朵大多呈含苞待放狀時，分別隨機選3株樹，選取樹冠中上部陽面的健康枝條，剪下帶回實驗室。將花枝下端剪成斜面，置于盛水的燒杯中水培，等待花朵自然開放，在燒杯下部鋪好硫酸紙。待花朵開放時，用毛筆刷收集剛開裂花藥里的成熟花粉，用離心管裝好備用[4]。

1.3 花粉生活力測定方法

1.3.1 離體培養(yǎng)法 本試驗中采用液體培養(yǎng)基法，蔗糖質(zhì)量濃度設(shè)4個水平，為25，50 ，75 ，100 g/L；硼酸質(zhì)量濃度設(shè)3個水平，為150 ，250 ，350 mg/L。共12種組合(見表1)。培養(yǎng)溫度設(shè)3個水平，為25，28，31 ℃。用膠頭滴管分別取12種培養(yǎng)液滴在凹面載玻片上，編好序號，撒適量新鮮花粉于培養(yǎng)液上混勻，放入恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個處理進行3次重復(fù)，用光學(xué)顯微鏡分別觀察花粉6，12，18，24 h的萌發(fā)率(試驗發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)超過24 h的花粉受真菌感染嚴重，故最終培養(yǎng)時間為24 h)。并分析花粉培養(yǎng)24 h后的萌發(fā)率，得出最佳培養(yǎng)基。花粉管的長度超過花粉粒直徑作為花粉萌發(fā)的標準。花粉萌發(fā)率(%)=(視野中花粉萌發(fā)數(shù)/視野中花粉總數(shù))×100%。

1.3.2 染色法 試驗中采取4種染色方法分別對3種槭屬植物新鮮花粉進行活力檢測，分別是TTC染色法[5]、I2-KI染色法[6]、過氧化酶染色法[7]、亞甲基藍染色法[8]。

表1 培養(yǎng)基組合的不同處理

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行分析，采用鄧肯氏新復(fù)極差法進行多重比較。

2 結(jié)果和分析

2.1 培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度對紅花槭花粉離體萌發(fā)的影響

紅花槭花粉經(jīng)過不同培養(yǎng)基與培養(yǎng)溫度培養(yǎng)24 h后，花粉萌發(fā)情況的多重比較結(jié)果如表2所示，紅花槭花粉在培養(yǎng)溫度28 ℃，75 g/L蔗糖+150 mg/L硼酸的培養(yǎng)基中萌發(fā)率最高，為81.95%，顯著高于其他處理。當蔗糖質(zhì)量濃度為25 g/L和50 g/L時，花粉的萌發(fā)率隨著硼酸質(zhì)量濃度的增加而增加。當蔗糖質(zhì)量濃度為75，100 g/L時，花粉的萌發(fā)率隨著硼酸質(zhì)量濃度的增加而減少。

2.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度對元寶楓花粉離體萌發(fā)的影響

元寶楓花粉經(jīng)過不同培養(yǎng)基與培養(yǎng)溫度培養(yǎng)24 h后，花粉萌發(fā)情況的多重比較結(jié)果如表3所示，元寶楓花粉在培養(yǎng)溫度25 ℃，100 g/L蔗糖+250 mg/L硼酸的培養(yǎng)基中萌發(fā)率最高，為66.7%，顯著高于其他處理。在不同溫度條件下，隨著蔗糖質(zhì)量濃度的增加，花粉萌發(fā)率的大體趨勢為先增加后減小。在同一溫度，同一蔗糖質(zhì)量濃度條件下，花粉萌發(fā)率基本隨硼酸的質(zhì)量濃度增加而增加。

表2 不同培養(yǎng)條件下紅花槭離體花粉萌發(fā)率 %

表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；同列數(shù)字后不同小寫字母表示P<0.05時存在顯著性差異

表3 不同培養(yǎng)條件下元寶楓離體花粉萌發(fā)率 %

表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；同列數(shù)字后不同小寫字母表示P<0.05時存在顯著性差異

2.3 培養(yǎng)基及培養(yǎng)溫度對糖槭花粉離體萌發(fā)的影響

糖槭花粉經(jīng)過不同培養(yǎng)基與培養(yǎng)溫度培養(yǎng)24 h后，花粉萌發(fā)情況的多重比較結(jié)果如表4所示，糖槭花粉在培養(yǎng)溫度28 ℃，25 g/L蔗糖+350 mg/L硼酸的培養(yǎng)基中萌發(fā)率最高，為88.37%，顯著高于其他處理。不同處理在培養(yǎng)溫度28 ℃時，萌發(fā)率普遍達到最大值。在同一溫度，同一蔗糖質(zhì)量濃度條件下，花粉萌發(fā)率基本隨硼酸的質(zhì)量濃度增加而增加。

表4 不同培養(yǎng)條件下糖槭離體花粉萌發(fā)率 %

表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；同列數(shù)字后不同小寫字母表示P<0.05時存在顯著性差異

2.4 3種槭屬植物花粉萌發(fā)過程

分別用篩選出的最佳培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)基，對3種槭屬植物花粉進行培養(yǎng)觀察，萌發(fā)率如圖1所示。研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)6 h，3種花粉的萌發(fā)率為21.96%—29.85%，其中紅花槭的萌發(fā)率最小，元寶楓的萌發(fā)率最大。在12 h時3種花粉均大量萌發(fā)，之后花粉萌發(fā)速率逐漸降低，并最終保持穩(wěn)定，直到24 h時達到最大值。最終萌發(fā)率大小關(guān)系為糖槭(88.37%)>紅花槭(81.95%)>元寶楓(66.70%)。

圖1 3種槭屬植物花粉萌發(fā)率隨培養(yǎng)時間的變化

2.5 不同花粉活力測定方法的比較

本試驗采用了4種染色法測定花粉萌發(fā)率，其中TTC和I2-IK染色法無法使花粉染色，故不能作為測定3種槭樹植物花粉活力的有效染色劑。而亞甲基藍染色法和過氧化物酶染色法能在短期內(nèi)使花粉染色，且效果明顯。由染色結(jié)果(見表7)可知，過氧化物酶染色法對紅花槭、元寶楓、糖槭花粉的檢測結(jié)果顯著高于離體萌發(fā)的花粉萌發(fā)率(P<0.05)；亞甲基藍染色法對元寶楓花粉的檢測結(jié)果顯著高于離體萌發(fā)的花粉萌發(fā)率(P<0.05)，而對其余2種槭屬植物花粉的檢測結(jié)果與離體萌發(fā)法相比無顯著差異(P>0.05)。

表7 3種方法檢測的花粉生活力

表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤；同列數(shù)字后不同小寫字母表示P<0.05時存在顯著性差異

3 結(jié)論與討論

花粉萌發(fā)常用的培養(yǎng)基有固體和液體2種，液體培養(yǎng)基操作相對簡便。其中蔗糖和硼酸是培養(yǎng)基的主要成分，大量的研究結(jié)果表明，不同植物的花粉萌發(fā)所需要的培養(yǎng)基種類和質(zhì)量濃度有所不同，一些較難萌發(fā)的花粉，還需添加其他成分，如Ca2+, K+, PEG等[9]。刺槐花粉的適宜萌發(fā)條件為150 g/L蔗糖+20 mg/L硼酸+0.5 mg/L硝酸鈣[10]。芒果花粉在液體培養(yǎng)基中，萌發(fā)率最高，可達50.14%[11]。絕大多數(shù)的桃品種的最佳培養(yǎng)基為10%蔗糖+0.1%硼酸+1%瓊脂[12]。因此很有必要對不同種類的花粉確立相對應(yīng)的適宜萌發(fā)條件。本研究發(fā)現(xiàn)，紅花槭花粉在培養(yǎng)溫度28 ℃，75 g/L蔗糖+150 mg/L硼酸的培養(yǎng)基中萌發(fā)率最高為81.95%；元寶楓花粉在培養(yǎng)溫度25 ℃，100 g/L蔗糖+250 mg/L硼酸的培養(yǎng)基中萌發(fā)率最高為66.7%；糖槭花粉在培養(yǎng)溫度28 ℃，25 g/L蔗糖+350 mg/L硼酸的培養(yǎng)基中萌發(fā)率最高為88.37%。在最佳培養(yǎng)基處理下，培養(yǎng)12 h后大部分花粉均萌發(fā)，隨后的花粉萌發(fā)率增加緩慢；培養(yǎng)24 h時，3種槭屬植物花粉的萌發(fā)率趨于穩(wěn)定，達到最大值。

張朋研究發(fā)現(xiàn)，紅花槭的最佳萌發(fā)條件為40 g/L蔗糖+200 mg/L硼酸+350 mg/L CaCl2，萌發(fā)率為55.67%[13]。王永格等對“麗紅”元寶楓的研究發(fā)現(xiàn)，其在培養(yǎng)溫度15 ℃，150 g/L蔗糖的條件下培養(yǎng)6 h，花粉萌發(fā)率最高，為31.6%；并且指出TTC和I2-IK不適合檢測“麗紅”元寶楓的花粉生活力[14]。王續(xù)蕾發(fā)現(xiàn)糖槭的最佳萌發(fā)條件是：培養(yǎng)溫度15 ℃，150 g/L蔗糖+300 mg/L硼酸，萌發(fā)率可達43.22%[15]。以上研究與本文結(jié)果有所差異，有可能是試驗材料的差異性以及花粉培養(yǎng)溫度不同導(dǎo)致，也可能是在不同的生長環(huán)境下，其適應(yīng)性發(fā)生了不同的變化而造成的。

花粉活力檢測的方法有很多，左丹丹等對其作了較為詳細的介紹，并分析了各種方法的特點[16]。詹妮等研究表明，I2-IK對大葉相思花粉的染色結(jié)果略高于離體萌發(fā)法，但2者差異不顯著[7]。孫愛芹等研究發(fā)現(xiàn)，I2-IK染色法對棗花粉的染色結(jié)果顯著高于離體萌發(fā)法[6]。本研究中，過氧化物酶法測得的結(jié)果普遍高于離體萌發(fā)法，差異顯著，可能是由于染色法測得的結(jié)果是花粉潛在的活力，而離體萌發(fā)法測得的結(jié)果是花粉的實際活力[17]；而TTC與I2-IK染色法無法使3種槭屬植物花粉染色，與王永格等、王續(xù)蕾的研究結(jié)果相同。原因可能是由于不同種類的花粉酶的活性與淀粉含量不同導(dǎo)致[6]。在實際工作中，染色法方便快捷，可用來快速檢測花粉的生活力，但有時活力較弱的花粉也會被染色，因此染色法測得的結(jié)果一般都比真實情況偏高[18]。本試驗的結(jié)果也證實了趙元杰等[19]的試驗結(jié)果。Smith-Huerta等認為，測定花粉受精有效性和種子形成的比率是測定植物花粉活力較為精確的方法[20]。因此，在測定花粉生活力時，應(yīng)結(jié)合研究目的與實際情況選擇合適的測定方法。

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