顱內(nèi)新型隱球菌感染對(duì)血-腦屏障乳腺癌耐藥蛋白功能的影響

王威，邵龍，鄭娜，蔣膠膠，張家堂

新型隱球菌是中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌感染最常見(jiàn)的病原菌，為條件致病菌，主要經(jīng)上呼吸道侵入體內(nèi)，當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時(shí)，可經(jīng)血行播散至腦[1-2]。新型隱球菌突破血-腦屏障的途徑主要包括：①跨細(xì)胞途徑：病原菌通過(guò)腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的吞飲作用直接入腦；②細(xì)胞間途徑：病原菌可以破壞血-腦屏障細(xì)胞間緊密連接入腦；③巨噬細(xì)胞途徑：病原菌被巨噬細(xì)胞吞噬后，隨巨噬細(xì)胞入腦[3]。隱球菌入腦后大量復(fù)制誘發(fā)炎性反應(yīng)，最終形成腦膜腦炎。氟康唑是隱球菌腦膜腦炎鞏固和維持治療階段的首選用藥[4]，通過(guò)干擾真菌細(xì)胞膜麥角固醇的合成而達(dá)到抑菌效果[5-6]。研究表明，表達(dá)于血-腦屏障毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)限制藥物入腦起關(guān)鍵作用[7]。本研究比較乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer-resistance proteins，BCRP)抑制劑泮托拉唑[6]對(duì)正常和顱內(nèi)新型隱球菌感染大鼠氟康唑血-腦屏障透過(guò)率的影響，以分析顱內(nèi)新型隱球菌感染對(duì)BCRP功能的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 氟康唑、泮托拉唑(中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京)；色譜級(jí)乙腈、甲醇(Tedia，美國(guó))；磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、二氯甲烷(國(guó)藥集團(tuán)，北京)。大鼠腦立體定位儀(Stoelting，美國(guó))，顱鉆(Saeshin，韓國(guó))，高效液相色譜儀(HPLC)及ZORBAX SB-C18色譜柱(Agilent，美國(guó))，微透析裝置(CMA，瑞典)。

1.2 動(dòng)物與分組 SPF級(jí)健康雄性SD大鼠27只，體重260～300g，購(gòu)自維通利華公司。3只用于微透析探針體內(nèi)回收率測(cè)定，其余24只隨機(jī)等分為4組，每組6只。A組：正常大鼠靜脈給予氟康唑；B組：正常大鼠靜脈給予氟康唑+BCRP抑制劑泮托拉唑；C組：大鼠采用顱內(nèi)接種法建立新型隱球菌腦膜腦炎模型后靜脈給予氟康唑；D組：大鼠建模后靜脈給予氟康唑+泮托拉唑。

1.3 大鼠新型隱球菌腦膜腦炎模型的建立 大鼠腹腔注射50mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，左側(cè)股動(dòng)脈置管用于血液標(biāo)本采集，股靜脈置管用于給藥。用立體定位儀固定大鼠頭部，切開(kāi)皮膚暴露顱骨，于紋狀體定位點(diǎn)(以前囟為坐標(biāo)原點(diǎn)，向前1mm，向右3mm)處打孔。用微量進(jìn)樣器將10μl新型隱球菌懸液(1×107cfu/ml，由解放軍總醫(yī)院微生物科提供)緩慢注入C、D組大鼠紋狀體(深度3.4mm)，A、B組大鼠注入等量生理鹽水。之后將微透析探針底座插入紋狀體，用牙科水泥和小螺絲將底座固定于顱骨表面。手術(shù)完成后大鼠單籠喂養(yǎng)，5d后用于微透析采樣。

1.4 微透析采樣

1.4.1 微透析探針體內(nèi)回收率測(cè)定 由于藥物經(jīng)過(guò)探針前的半透膜會(huì)有一定損失率，因此需要測(cè)定探針在體內(nèi)的回收率以校正透析液中氟康唑的濃度[8]。具體方法為：將微透析探針插入探針底座并連接微透析裝置，將含有1μg/ml氟康唑的人工腦脊液(NaCl 140.3mmol/L，KCl 2.7mmol/L，CaCl21.2mmol/L，MgCl21.0mmol/L)以1.5μl/min的流速持續(xù)向探針流入管灌注，從流出管采集微透析液。采用高效液相色譜法測(cè)定灌流液及透析液中氟康唑的濃度。氟康唑體內(nèi)探針回收率=(灌流液中氟康唑的濃度－透析液中氟康唑的濃度)/灌流液中氟康唑的濃度[9]。

1.4.2 微透析采樣 大鼠連接微透析裝置，用人工腦脊液以1.5μl/min的流速持續(xù)灌注，經(jīng)1h平衡期后，A、C組大鼠經(jīng)股靜脈置管注入氟康唑(20mg/kg)，B、D組大鼠在注入氟康唑前30min經(jīng)股靜脈置管注入泮托拉唑(40mg/kg)。以20min為間隔持續(xù)采集紋狀體腦細(xì)胞外液至給藥后300min。同時(shí)，通過(guò)股動(dòng)脈置管于給藥后5、10、15、30、45、60、90、150、210、300min采集外周血標(biāo)本，每次200μl，高速離心后取血漿保存于–20℃冰箱中。

1.5 氟康唑濃度測(cè)定

1.5.1 血標(biāo)本去蛋白處理 取100μl血漿，加入5mol/L氫氧化鈉20μl、二氯甲烷5ml，3000r/min離心10min后經(jīng)氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00μl流動(dòng)相復(fù)溶，取20μl注入HPLC自動(dòng)進(jìn)樣裝置[10]。

1.5.2 氟康唑濃度測(cè)定 采用HPLC測(cè)定透析液及血漿中氟康唑的濃度。流動(dòng)相組成[11]：10mmol/L磷酸氫二鉀緩沖液-乙腈(72∶28，V/V)，pH調(diào)至5.7。流速1.0ml/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)261nm。透析液中氟康唑濃度需除以微透析探針體內(nèi)回收率以得到紋狀體腦細(xì)胞外液中的氟康唑濃度。

1.6 腦組織中新型隱球菌菌體的染色觀察C、D組大鼠微透析采樣結(jié)束后，進(jìn)行主動(dòng)脈灌注使腦組織固定，灌注結(jié)束后將腦組織放入4%多聚甲醛溶液中保存以備制作病理切片。切片采取石蠟包埋，PAS染色[12]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism V6.02軟件繪制氟康唑濃度-時(shí)間曲線，梯形法則計(jì)算血漿細(xì)胞外液氟康唑濃度-時(shí)間曲線下面積(AUCPlasma)及腦細(xì)胞外液(brain extracellular fluid, Brain ECF)氟康唑濃度-時(shí)間曲線下面積(AUCBrainECF)，并由公式AUCBrainECF/AUCPlasma計(jì)算氟康唑的血-腦屏障透過(guò)率。采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，滿(mǎn)足正態(tài)性，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)　果

2.1 大鼠建模情況 經(jīng)顱內(nèi)接種新型隱球菌后，C、D組大鼠在微透析采樣前相繼出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)減少、易激惹、毛發(fā)豎立等表現(xiàn)，腦組織切片PAS染色鏡下觀察可見(jiàn)腦膜與腦實(shí)質(zhì)內(nèi)有淡紅色圓形或卵圓形隱球菌菌體(圖1)，證實(shí)大鼠新型隱球菌腦膜腦炎模型建立成功。

2.2 各組大鼠氟康唑血-腦屏障透過(guò)率的比較 C組大鼠AUCBrainECF及氟康唑血-腦屏障透過(guò)率均明顯高于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，表1)。B組大鼠氟康唑在血及腦細(xì)胞外液中的分布與A組基本一致，BCRP抑制劑泮托拉唑并未改變氟康唑的血-腦屏障透過(guò)率。D組大鼠AUCBrainECF及血-腦屏障透過(guò)率均明顯高于C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2、表1)。

圖1 大鼠腦組織切片PAS染色鏡下觀察(×40)Fig. 1 Infected rat brain tissues (Periodic acid-Schiff staining,×40)

表1 氟康唑血及腦細(xì)胞外液濃度-時(shí)間曲線下面積及血-腦屏障透過(guò)率(±s，n=6)Tab. 1 Area under the fluconazole concentration-time curve (AUC) and fluconazole blood-brain barrier (BBB) penetration (±s, n=6)

表1 氟康唑血及腦細(xì)胞外液濃度-時(shí)間曲線下面積及血-腦屏障透過(guò)率(±s，n=6)Tab. 1 Area under the fluconazole concentration-time curve (AUC) and fluconazole blood-brain barrier (BBB) penetration (±s, n=6)

BBB penetration= AUCBrainECF/ AUCPlasma; (1)P＜0.05 compared with group A; (2)P＜0.05 compared with group C

Parameters　Group A　Group B　Group C　Group D AUCPlasma (mg.min/L)　4587±507　4550±532　4533±508　4540±487 AUCBrainECF (mg.min/L)　2853±508　2830±489　3600±285(1)　4114±321(2)BBB penetration (%)　62.7±12.4　63.0±12.1　79.9±7.8(1)　91.2±9.1(2)

圖2 大鼠血及腦細(xì)胞外液氟康唑濃度-時(shí)間曲線(±s，n=6)Fig. 2 Concentration-time profiles for mean unbound fluconazole in plasma and brain extracellular fluid ±s, n=6)

3 討　論

近年來(lái)，顱內(nèi)新型隱球菌感染發(fā)病率逐漸升高，該病病情重，病死率高，而多種抗真菌藥物難以順利透過(guò)血-腦屏障抵達(dá)病灶部位，其療效受到了影響。本研究利用顱內(nèi)接種法[13]成功構(gòu)建了新型隱球菌腦膜腦炎大鼠模型，并發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)新型隱球菌感染可以顯著提高氟康唑的血-腦屏障透過(guò)率，這一結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道感染因素可破壞血-腦屏障結(jié)構(gòu)功能[14]相一致。這可能與新型隱球菌對(duì)血-腦屏障結(jié)構(gòu)的機(jī)械性破壞有關(guān)。血-腦屏障由腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及細(xì)胞間緊密連接，基膜、周細(xì)胞以及星形膠質(zhì)細(xì)胞腳板圍成的神經(jīng)膠質(zhì)膜構(gòu)成[15]，新型隱球菌可通過(guò)穿透腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞或松解細(xì)胞間緊密連接而破壞血-腦屏障，使氟康唑腦內(nèi)分布增多。此外，真菌感染誘發(fā)炎性反應(yīng)所釋放的細(xì)胞因子，也可通過(guò)降低跨內(nèi)皮電阻(transendothelial electrical resistance，TEER)破壞內(nèi)皮細(xì)胞層完整性，從而降低血-腦屏障對(duì)氟康唑的抵抗[16]。

BCRP是ATP結(jié)合盒式蛋白的一種，為血-腦屏障毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)量?jī)H次于P糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[17]。BCRP可以通過(guò)結(jié)合并水解ATP提供能量，將進(jìn)入腦內(nèi)的藥物排出，應(yīng)用BCRP抑制劑可提高藥物的血-腦屏障透過(guò)率。但本研究結(jié)果顯示，正常大鼠在應(yīng)用BCRP抑制劑泮托拉唑后，氟康唑的血-腦屏障透過(guò)率并未發(fā)生變化，表明外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白BCRP并未參與正常大鼠血-腦屏障對(duì)氟康唑的抵抗，而感染大鼠在應(yīng)用泮托拉唑后，氟康唑的血-腦屏障透過(guò)率明顯升高，表明BCRP參與了新型隱球菌腦膜腦炎大鼠血-腦屏障對(duì)氟康唑的抵抗。以上結(jié)果提示生理情況下BCRP的外排作用并未激活，而新型隱球菌感染通過(guò)某些機(jī)制激活了BCRP對(duì)氟康唑的外排作用。這可能與BCRP的結(jié)構(gòu)有關(guān)，BCRP由多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域組成，每個(gè)結(jié)構(gòu)域之間通過(guò)環(huán)形保護(hù)結(jié)構(gòu)彼此相連形成拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，而跨膜結(jié)構(gòu)域中的底物結(jié)合位點(diǎn)則隱藏在這種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)之中。新型隱球菌感染引起的機(jī)械性破壞及炎性反應(yīng)使BCRP拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)發(fā)生改變，底物結(jié)合位點(diǎn)暴露，從而使BCRP外排功能被激活[18-19]。因此感染大鼠在應(yīng)用BCRP抑制劑后，氟康唑的血-腦屏障透過(guò)率明顯升高。

綜上所述，顱內(nèi)新型隱球菌感染可以破壞血-腦屏障的結(jié)構(gòu)功能，但同時(shí)激活了外排蛋白的作用，使血-腦屏障的功能得到補(bǔ)償。由于新型隱球菌性腦膜腦炎治療周期長(zhǎng)，長(zhǎng)期應(yīng)用抗真菌藥物的毒副作用較大，因此在不增加藥量的情況下提高抗真菌藥物血-腦屏障透過(guò)率對(duì)縮短治療周期、提高療效十分重要。本研究結(jié)果表明，外排蛋白BCRP抑制劑有助于提高感染模型大鼠氟康唑的血-腦屏障透過(guò)率，但可能同時(shí)也削弱了血-腦屏障對(duì)神經(jīng)毒素或其他有害外源物質(zhì)的屏障作用，其臨床應(yīng)用的安全性及有效性仍須進(jìn)一步深入研究。

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