京尼平苷對LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞活化及炎性反應(yīng)的抑制作用

張 冷，葉 齊，徐之良*

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院兒科，武漢 430060；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福州 350002)

星形膠質(zhì)細胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最豐富的膠質(zhì)細胞群，對神經(jīng)元起著保護、支持和營養(yǎng)的作用[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細胞上表達有多種受體，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)起著重要作用。激活的星形膠質(zhì)細胞可釋放多種致炎細胞因子和趨化因子，作用于小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，可直接引起或擴大炎癥反應(yīng)[2]。因此，通過調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞上的相關(guān)受體抑制星形膠質(zhì)細胞活化，從而抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)，對多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有重要意義[3]。

京尼平苷是茜草科(Rubiaceae)植物梔子(GardeniajasminoidesEllis) 的主要成分，為環(huán)烯醚萜葡萄糖苷類化合物。文獻報道，京尼平苷具有多種藥理活性，包括抗炎鎮(zhèn)痛、保肝利膽、神經(jīng)營養(yǎng)和保護、降血糖以及調(diào)血脂等作用[4]。有報道表明，京尼平苷對神經(jīng)炎癥具有較好的調(diào)節(jié)作用[5]，但其作用機制尚不完全清楚。因此，本研究探索京尼平苷對LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞炎性反應(yīng)的抑制作用及分子機制。

1 儀器與材料

1.1儀器 CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)；潔凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；蛋白電泳儀(美國Bio-Rad公司)；酶標(biāo)儀(美國BioTek Instruments公司)；熒光正置顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2試藥 京尼平苷(GE)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于 98%，批號140815，南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司；白藜蘆醇(RES)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于99%，武漢欣欣佳麗生物科技有限公司；DMSO和LPS，購于Sigma公司；DMEM/F12培養(yǎng)基，HyClone公司；Anti-GFAP antibody(ab7260)、TNF-α、IL-6和 IL-1β， ELISA檢測試劑盒(美國Abcam公司)；BCA蛋白定量試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.3動物 清潔級雄性SD乳鼠，許可證號：SCXK(滬)2012-0002，上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供。

2 方法

2.1原代星形膠質(zhì)細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 取出生1～3 d 的SD乳鼠，斷頭后剪開顱骨，取大腦皮層，剝離腦膜及血管，剪碎大腦皮層，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰酶消化，以1 000 r·min-1離心，棄上清液，用質(zhì)量濃度為100 g·L-1FBS的DMEM/F12 培養(yǎng)基洗滌、重懸，200目篩網(wǎng)過濾，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% 的CO2培養(yǎng)箱中，差速黏附去除成纖維細胞。繼續(xù)培養(yǎng)并純化后，細胞爬片進行GFAP免疫熒光染色鑒定純度。

2.2分組及給藥處理 將原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞隨機分為5組：對照組加入含質(zhì)量濃度為100 g·L-1FBS的DMEM/F12 培養(yǎng)基；LPS組加入含終質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1的LPS培養(yǎng)基；藥物處理組細胞預(yù)先加入相應(yīng)終濃度為50 μmol·L-1的白藜蘆醇或0.1，1和10 μmol·L-1的京尼平苷作用12 h后，再置于終質(zhì)量濃度為1 μg·mL-1的LPS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。

2.3酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA) 各處理組星形膠質(zhì)細胞用含1 mmol·L-1PMSF 的NP-40 裂解液裂解，置于4 ℃ 低溫離心機中，以12 000 r·min-1離心5 min，上清液為總蛋白，用BCA法測定蛋白質(zhì)量濃度。根據(jù)ELISA試劑盒說明書方法測定各細胞因子的含量。

2.4Western Blot法 各組星形膠質(zhì)細胞按照ELISA法提取蛋白，配制質(zhì)量濃度分別為120和50 g·L-1的分離膠和濃縮膠，上樣后進行電泳，待酚藍跑到凝膠底部時即可停止電泳，使用PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時恒壓100 V，時間為1.5 h；用質(zhì)量濃度為50 g·L-1的脫脂奶粉封閉液室溫封閉1～2 h,用一抗4 ℃冰箱的搖床孵育過夜(GFAP，1∶20 000；NF-κB，1∶1 000；GAPDH，1∶20 000)；繼而二抗室溫孵育1～2 h，清洗后用ECL發(fā)光液發(fā)光顯影，用Image J對蛋白條帶的灰度進行量化統(tǒng)計，GAPDH為內(nèi)參蛋白。

3 結(jié)果

3.1原代星形膠質(zhì)細胞鑒定 GFAP是星形膠質(zhì)細胞骨架蛋白，特異性表達于星形膠質(zhì)細胞，通過免疫熒光細胞化學(xué)法鑒定星形膠質(zhì)細胞純度。藍色熒光為DAPI染的細胞核，紅色熒光為GFAP，星形膠質(zhì)細胞純度=星形膠質(zhì)細胞數(shù)(紅色熒光標(biāo)記)/細胞總數(shù)(藍色)×100%。隨機挑選5個視野統(tǒng)計結(jié)果。結(jié)果顯示，GFAP陽性細胞數(shù)為95%以上，可用于后續(xù)實驗。見圖1。

3.2京尼平苷對LPS誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞活化的影響 采用Western Blot法，以GFAP蛋白水平為指標(biāo)，觀察京尼平苷對LPS誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞的活化作用。結(jié)果見圖2。由圖2可知，與對照組比較，LPS模型組GFAP蛋白水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；陽性對照組白藜蘆醇顯著降低GFAP蛋白水平(P<0.01)；京尼平苷可抑制LPS誘導(dǎo)的GFAP蛋白水平增高，與LPS組比較，京尼平苷處理后GFAP蛋白水平下降，1 μmol·L-1京尼平苷的作用較弱(P<0.05)，10 μmol·L-1的京尼平苷能抑制GFAP蛋白水平升高(P<0.01)，0.1 μmol·L-1京尼平苷未能抑制GFAP蛋白水平(P>0.05)。

圖1大鼠大腦皮層原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞免疫熒光圖

Fig.1 Immunofluorescence of primary cultured astrocytes from rat cerebral cortex

圖2京尼平苷對LPS誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞GFAP的影響

注：與對照組比較##P<0.01；與LPS組比較*P<0.05，

**P<0.01。

Fig.2 Effects of geniposide on LPS-induced GFAP activities in astrocytes

Note:##P<0.01 vs control group；*P<0.05，**P<0.01 vs LPS group.

3.3京尼平苷對LPS誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞致炎細胞因子的影響 與對照組比較，LPS誘導(dǎo)原代星形膠質(zhì)細胞24 h后，細胞上清液IL-1β、IL-6 和TNF-α蛋白水平顯著升高(P<0.01)；LPS+白藜蘆醇組顯著降低IL-1β、IL-6 和TNF-α蛋白水平(P<0.01)，而京尼平苷各處理組對IL-1β、IL-6 和TNF-α蛋白水平呈質(zhì)量濃度依賴性抑制作用，但與LPS組比較，低濃度京尼平苷組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，中、高濃度組均可顯著降低IL-1β、IL-6 和TNF-α蛋白水平(P<0.01)。見表1。

表1京尼平苷對LPS誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞致炎細胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的影響

Tab.1 Effects of geniposide on protein expression of IL-1β，IL-6 and TNF-αin LPS induced astrocytes

組別IL-1βlevel/ng·L-1IL-6level/ng·L-1TNF-αlevel/ng·L-1空白對照組8.4±1.71.4±0.212.8±0.48LPS組127.4±11.9##13.4±2.7**17.2±2.2##LPS+RES組(50μmol·L-1)63.7±7.8**4.4±0.85**4.1±1.8**LPS+GE組(0.1μmol·L-1)118.6±7.19.8±2.116.4±3.2LPS+GE組(1μmol·L-1)88.6±9.5*7.4±1.2**11.4±1.8**LPS+GE組(10μmol·L-1)72.8±8.8**5.4±0.4**4.6±1.9**

注：與對照組比較**P<0.01；與LPS組比較#P<0.05，##P<0.01。

3.4京尼平苷對LPS誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞NF-κB p65蛋白水平的影響 LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞NF-κB p65水平顯著升高，與LPS組比較，LPS+白藜蘆醇組顯著降低NF-κB p65水平，而低濃度京尼平苷組對NF-κB p65蛋白水平影響不大，中、高濃度京尼平苷組可顯著降低其表達水平(P<0.05，P<0.01)。見圖3。

圖3京尼平苷對LPS誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞NF-κBp65的影響

注：與對照組比較##P<0.01；與LPS組比較*P<0.05，**P<0.01。

Fig.3 Effects of geniposide on protein expression of NF-κB p65 on LPS induced astrocytes

Note:##P<0.01 vs control group；*P<0.05，**P<0.01 vs LPS group.

4 討論

神經(jīng)膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥在多種疾病中起著重要作用，如神經(jīng)病理性疼痛、阿爾茲海默癥和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[6]。星形膠質(zhì)細胞是神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的膠質(zhì)細胞，可通過小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元形成神經(jīng)免疫網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮病理、生理功能[7]。在多種疾病狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細胞會活化，釋放大量致炎細胞因子和趨化因子等啟動并促進炎癥反應(yīng)的進展[8]。多種神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病的發(fā)病機制尚不清楚，缺乏有效的治療措施和藥物，或因某些藥物嚴(yán)重的毒性和不良反應(yīng)限制其臨床應(yīng)用。因此，尋找新靶點和新作用機制的藥物具有重要意義。

京尼平苷是中藥梔子中環(huán)烯醚萜苷類的化學(xué)成分，有文獻通過細胞或動物實驗證實，京尼平苷對多種神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病有較好的作用[9]，如阿爾茲海默癥、糖尿病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。鑒于其較好的抗炎活性，本實驗在原代培養(yǎng)的大鼠皮層星形膠質(zhì)細胞上證明其抗炎活性及可能機制。GFAP是一種主要存在于星形膠質(zhì)細胞中的中間絲蛋白，也是星形膠質(zhì)細胞的骨架蛋白，其表達水平可用于判斷星形膠質(zhì)細胞的活化情況[10]。本實驗通過觀察GFAP水平變化，發(fā)現(xiàn)LPS可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞活化，而1 和10 μmol·L-1京尼平苷可顯著抑制其活化。此外，ELISA實驗證實LPS還可使星形膠質(zhì)細胞活化后的IL-1β、IL-6和TNF-α等致炎細胞因子水平顯著升高，而京尼平苷可抑制這些細胞因子的升高。TNF-α、IL-1β和IL-6是較常見的致炎細胞因子，可激活放大多種炎癥反應(yīng)，參與體內(nèi)炎癥反應(yīng)、細胞生存、生長、分化和細胞凋亡等多種重要的病理生理反應(yīng)[11-12]。文獻報道，京尼平苷在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型及阿爾茲海默癥小鼠模型上可顯著抑制TNF-α和IL-1β水平[9，13]，這與本實驗結(jié)果相吻合，本實驗從細胞水平進一步明確了京尼平苷具有較好的抗炎作用。同時，實驗還檢測到京尼平苷可顯著抑制NF-κB p65蛋白的活化。NF-κB p65蛋白是一種廣泛存在于真核細胞中的轉(zhuǎn)錄因子，其活化能調(diào)控一系列基因的表達[14]，如炎性細胞因子TNF-α和IL-1β等，引發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng)[15]，加速細胞凋亡，直接或間接地參與一系列病理過程[16]。因此，京尼平苷可通過抑制NF-κB途徑降低致炎細胞因子水平，達到抗炎作用。

膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)是研究的熱點，抑制星形膠質(zhì)細胞過度活化是有效手段之一[17]。本實驗觀察到京尼平苷可抑制星形膠質(zhì)細胞活化，致炎細胞因子IL-1β、IL-6 和TNF-α的水平以及NF-κB p65蛋白活化?；谏鲜銮闆r，推測京尼平苷抗慢性炎性作用可通過NF-κB途徑抑制LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞活化，并抑制致炎細胞因子水平，該作用可能與京尼平苷抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、阿爾茲海默癥等神經(jīng)炎癥疾病具有一定關(guān)系。本實驗為京尼平苷治療相關(guān)炎癥性疾病提供了理論依據(jù)。

[1] Sofroniew M V，Vinters H V.Astrocytes:biology and pathology [J].Acta neuropathol，2010，119(1):7-35.

[2] 高永靜，紀(jì)如榮.星形膠質(zhì)細胞調(diào)節(jié)慢性疼痛的分子機制[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2013，19(9):545-552.

[3] 高永靜，張志軍，曹德利.趨化因子介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)和神經(jīng)病理性疼痛[J].中國細胞生物學(xué)學(xué)報，2014,36(3):297-307.

[4] 史卉妍，何鑫，歐陽冬生，等.京尼平苷及其衍生物的藥效學(xué)研究進展[J].中國藥學(xué)雜志，2006，41(1):4-6.

[5] Shi Q，Cao J，F(xiàn)ang L，et al.Geniposide suppresses LPS-induced nitric oxide，PGE2 and inflammatory cytokine by downregulating NF-κB，MAPK and AP-1 signaling pathways in macrophages[J].Int Immunopharmacol，2014，20(2):298-306.

[6] Ji R R，Chamessian A，Zhang Y Q.Pain regulation by non-neuronal cells and inflammation[J].Science，2016，354(6312):572-577.

[7] 黃琳，萬琪.星形膠質(zhì)細胞參與神經(jīng)病理痛機制的研究進展[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2013，19(1):52-54.

[8] 金小高，羅愛林，王金韜，等.脊髓神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞激活在三種神經(jīng)病理性疼痛大鼠模型脊髓水平致痛機制中的作用[J].中華麻醉學(xué)雜志，2006，26(1):71-74.

[9] Lv C，Wang L，Liu X，et al.Multi-faced neuroprotective effects of geniposide depending on the RAGE-mediated signaling in an Alzheimer mouse model[J].Neuropharmacology，2015，(89):175-184.

[10]靳輝，馮改豐，楊蓬勃，等.大鼠腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細胞的體外優(yōu)化培養(yǎng)及鑒定[J].西安交通大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2015,36(6):849-853.

[11]鐘敏，曾因明，柳垂亮，等.脊髓TNFα、IL-1β和IL-6在神經(jīng)病理性疼痛過程中的表達變化[J].中國疼痛醫(yī)學(xué)雜志，2010，16(1):42-44.

[12]丁永忠，孫群周，張建生.急性顱腦損傷后血清TNF-α，IL-1，IL-6，IL-8含量變化及其臨床意義[J].中國臨床神經(jīng)外科雜志，2006，11(1):17-19.

[13]Dai M M，Wu H，Li H，et al.Effects and mechanisms of geniposide on rats with adjuvant arthritis [J].Int Immunopharmacol，2014，20(1):46-53.

[14]Baker R G，Hayden M S，Ghosh S.NF-κB，inflammation，and metabolic disease[J].Cell Metabol，2011，13(1):11.

[15]宋來新，張長城，王婷，等.淫羊藿總黃酮通過抑制MAPK/NF-κB信號通路減輕自然衰老大鼠腦組織炎癥反應(yīng)[J].中國藥理學(xué)通報，2017，33(1):84-90.

[16]陶立德，薛同敏，張杰，等.缺血預(yù)處理對大鼠缺血再灌注肝組織NF-κB表達、炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響[J].中國普通外科雜志，2015，24(1):70-74.

[17]張先紅，申文，王明德，等.鞘內(nèi)注射膠質(zhì)細胞抑制劑對CCD大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞的影響[J].醫(yī)學(xué)臨床研究，2008，25(11):1925-1927.