超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)快速鑒定復(fù)方延寄參膠囊的化學(xué)成分

盧新義，何 娟，陳衍斌*，楊若瑾，馬九太，孫宇宏，孫寶平，程薇薇

(1.陜西國(guó)際商貿(mào)學(xué)院，咸陽(yáng) 712000；2.陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，西安 710075)

冠心病心絞痛是發(fā)生在中等動(dòng)脈中的一種慢性特異性炎癥反應(yīng)[1-2]。復(fù)方延寄參膠囊是由延胡索、人參、骨碎補(bǔ)和北劉寄奴4味中藥材制備而成，具有活血通脈止痛、益氣強(qiáng)心之功效。其中君藥延胡索，辛苦溫、入心肝脾經(jīng)，具有活血行氣止痛的功效；臣藥北劉寄奴，苦溫，入心經(jīng)，具有破血通經(jīng)、散瘀止痛的功效；臣藥人參，甘苦溫，入心脾經(jīng)，具有大補(bǔ)元?dú)狻⒁嫘臍?、安心神的功效；佐藥骨碎補(bǔ)，苦溫，亦入心經(jīng)，具有活血止痛的功效[3-4]。在藥效學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)復(fù)方延寄參膠囊可從多方面對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化所引起的病理?yè)p傷進(jìn)行修復(fù)，緩解所引發(fā)的心臟不適癥狀[5]。超高效液相色譜-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF-MS)是一種將色譜的高效在線分離與質(zhì)譜的高靈敏度、高分辨率完美結(jié)合的聯(lián)用技術(shù)，能夠準(zhǔn)確快速地對(duì)藥材的化學(xué)成分進(jìn)行定性分析[6-10]。本研究利用UPLC-Q-TOF-MS法對(duì)復(fù)方延寄參膠囊甲醇提取物進(jìn)行全成分分析，通過(guò)高分辨質(zhì)譜分析結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)及相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)復(fù)方延寄參膠囊化學(xué)成分進(jìn)行快速鑒別，旨在為復(fù)方延寄參膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 H-Class型超高效液相色譜儀、G2-XSQTOF型質(zhì)譜儀、Masslynx 4.1工作站(美國(guó)Waters公司)；DV215CD型電子天平(德國(guó)梅特勒-托利多公司)；KUDOS型超聲儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；TDL-5A型低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；優(yōu)普超純水機(jī)(成都超純科技有限公司)。

1.2試藥 復(fù)方延寄參膠囊(陜西步長(zhǎng)制藥有限公司，批號(hào)：1607121，1607122，1607131)；色譜純甲酸(Sigma公司)；色譜純甲醇、乙腈(美國(guó)Fisher公司)；水為脫氣超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1樣品溶液的制備 稱取復(fù)方延寄參膠囊0.5 g，研細(xì)，置于50 mL錐形瓶中，加入25 mL色譜甲醇，超聲(頻率53 kHz，功率500 W)30 min后，將混懸液以5 000 r·min-1離心15 min，取上清液，用色譜甲醇稀釋100倍，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，備用。

2.2色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLCTMBEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流速為0.4 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣體積為2 μL；流動(dòng)相為1 mL·L-1甲酸溶液(A)和乙腈(B)；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1梯度洗脫程序

Tab.1 The gradient elution program

時(shí)間/min流動(dòng)相A/%流動(dòng)相B/%095557030123070 12.1095515955

2.3質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源(ESI)；毛細(xì)管電壓：1.0 kV；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：800 L·h-1；霧化氣壓力：35 psi；碎裂電壓：135 V；負(fù)離子模式下掃描檢測(cè)，一級(jí)質(zhì)譜掃描范圍：100～1 000m/z，二級(jí)質(zhì)譜掃描范圍：50～1 000m/z；參比離子設(shè)置為m/z554.261 5。

2.4數(shù)據(jù)分析 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用MassLynx 4.1軟件進(jìn)行峰提取，UNIFI軟件進(jìn)行峰識(shí)別，結(jié)合Massbank和Human Metabolome Database(HMDB)及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

3 結(jié)果

本研究在負(fù)離子模式下共定性鑒別出16種化合物，包括人參皂苷類化學(xué)成分10種、黃酮類化學(xué)成分3種和酚酸類化學(xué)成分3種。復(fù)方延寄參膠囊3批樣品(批號(hào)：1607121，1607122，1607131)醇提物在負(fù)離子模式下的總離子流圖見(jiàn)圖1。復(fù)方延寄參膠囊(批號(hào)1607121)樣品醇提物在負(fù)離子模式下的總離子流圖見(jiàn)圖2。各化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

圖1復(fù)方延寄參膠囊(批號(hào)：1607121，1607122，1607131)醇提物總離子流圖(負(fù)離子模式)

Fig.1 The total ion chromatogram of methanol extract of Compound Yanjishen Capsules(Lot:1607121，1607122，1607131)(negative mode)

圖2復(fù)方延寄參膠囊(1607121)醇提物總離子流圖(負(fù)離子模式)

Fig.2 The total ion chromatogram of methanol extract of Compound Yanjishen Capsules(1607121)(negative mode)

3.1人參皂苷類化學(xué)成分解析 人參皂苷類在負(fù)離子模式下鑒別出人參皂苷類化合物共10種，按照保留時(shí)間先后順序分別是：三七皂苷R1(7)、人參皂苷Re(8)、人參皂苷Rf(9)、人參皂苷Rg1(10)、人參皂苷Rb1(11)、人參皂苷Rd(12)、人參皂苷Ro(13)、人參皂苷Rb2(14)、人參皂苷Ra1(15)和人參皂苷Rg3(16)。具體解析和歸屬過(guò)程如下：

在負(fù)離子模式下，人參皂苷類成分的準(zhǔn)分子離子峰為[M+COOH]-及[M-H]-，在二級(jí)質(zhì)譜中，此類化學(xué)成分易發(fā)生糖苷鍵的斷裂。對(duì)于人參二醇型、三醇型和齊墩果酸型，其裂解途徑是糖鏈取代基的斷裂，產(chǎn)生去糖基化離子，普遍產(chǎn)生了[M+COOH-162]-或[M-H-162]-(失去1個(gè)糖苷取代基m/z162)及[M+COOH-324]-或[M-H-324]-(失去2個(gè)糖苷取代基m/z324)等脫糖基離子。但由于母核結(jié)構(gòu)不同，該類成分的二級(jí)質(zhì)譜中也產(chǎn)生了一些不同的特征碎片離子，如二醇型m/z459，三醇型m/z475和齊墩果烷型m/z455等[11]。

表2復(fù)方延寄參膠囊(1607121)醇提物在負(fù)離子模式下的UPLC-Q-TOF-MS分析結(jié)果

Tab.2 Analysis results for the methanol extracts of Compound Yanjishen Capsules (1607121) by UPLC-Q-TOF-MS in negative ion mode

峰號(hào)保留時(shí)間/min加合物實(shí)測(cè)值m/z誤差/ppm 分子式化合物名稱離子碎片10.69[M-H]-115.0033-3.00C4H4O4富馬酸115,7121.36[M-H]-153.01950.90C7H6O4原兒茶酸153,10932.37[M-H]-179.03440.78C9H8O4咖啡酸179,13543.39[M-H]-595.16691.23C27H32O15新北美圣草苷595,28753.51[M-H]-271.06111.96C15H12O5柚皮素271,15063.76[M-H]-579.1709-0.64C27H32O14柚皮苷579,459,27174.82[M-H]-931.5260-0.61C47H80O18三七皂苷R1931,799,637,47584.95[M-H]-945.5420-0.18C48H82O18人參皂苷Re945,783,637,47595.08[M-H]-844.4812-3.30C42H72O14人參皂苷Rf844,799,475105.29[M-H]-799.48470.54C42H72O14人參皂苷Rg1799,637,553,475115.99[M-H]-1107.59600.84C54H92O23人參皂苷Rb11107,945,825,783,621,459126.53[M-H]-945.54290.77C48H82O18人參皂苷Rd945,783,621,459137.23[M-H]-955.49050.35C48H76O19人參皂苷Ro955,793,455147.45[M-H]-1077.5832-1.20C53H90O22人參皂苷Rb21077,945,915,783,765,459157.72[M-H]-1209.62811.20C58H98O26人參皂苷Ra11209,1047,885,621,459168.29[M-H]-783.48990.68C42H72O13人參皂苷Rg3783,621,609,537,459

化合物7的保留時(shí)間為4.82 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z931.526 0為 [M-H]-。在二級(jí)質(zhì)譜中，特征碎片離子m/z799.482 0為[M-H-xyl]-，特征碎片離子m/z637.433 4為 [M-H-xyl-glu]-，m/z475.379 8為 [M-H-xyl-glu-glu]-即皂苷苷元。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[12]，可鑒定為三七皂苷R1。同理鑒定出化合物8為人參皂苷Re，化合物9為人參皂苷Rf，化合物10為人參皂苷Rg1。以上4種人參皂苷均屬于人參三醇型皂苷，在二級(jí)質(zhì)譜圖中除了具有脫去糖鏈的碎片離子外，還具有屬于人參二醇型皂苷特殊的m/z475碎片離子,即皂苷苷元。

化合物12的保留時(shí)間為6.53 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z945.542 9，為 [M-H]-。在二級(jí)質(zhì)譜圖中，出現(xiàn)的碎片離子m/z783.488 1為[M-H-glu]-，碎片離子m/z621.438 0為[M-H-glu-glu]-，碎片離子m/z459.382 9為皂苷苷元。其裂解符合典型的人參二醇型皂苷裂解規(guī)律，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[12]，可鑒定為人參皂苷Rd。同理，鑒定出化合物11為人參皂苷Rb1，化合物14為人參皂苷Rb2，化合物15為人參皂苷Ra1，化合物16為人參皂苷Rg3。以上5種人參皂苷均屬于人參二醇型皂苷，在二級(jí)質(zhì)譜圖中除了具有脫去糖鏈的碎片離子外，還具有屬于人參二醇型皂苷特殊的m/z459碎片離子，即皂苷苷元。

化合物13的保留時(shí)間為7.23 min，準(zhǔn)分子離子峰m/z955.490 5為[M-H]-。在二級(jí)質(zhì)譜中，特征碎片離子m/z793.435 0為[M-H-glu]-，m/z455.201 1為皂苷苷元。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[12]，可鑒定為人參皂苷Ro，屬于齊墩果烷型人參皂苷，二級(jí)質(zhì)譜圖中具有其特征的碎片離子m/z455.201 1，即皂苷苷元。

人參皂苷類以人參皂苷Rd為例圖示二級(jí)質(zhì)譜圖、分子結(jié)構(gòu)及裂解途徑，見(jiàn)圖3。

3.2黃酮類化學(xué)成分解析 黃酮類在負(fù)離子模式下，共鑒別出3種黃酮類化合物，具體解析過(guò)程如下：

化合物4的保留時(shí)間為3.39 min，在負(fù)離子模式下，m/z595.166 9為[M-H]-，在二級(jí)質(zhì)譜圖中出現(xiàn)的m/z287.104 2離子峰為糖苷鍵斷裂所產(chǎn)生的碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)[13]報(bào)道，推測(cè)該化合物為新北美圣草苷。

化合物5的保留時(shí)間為3.51 min，在負(fù)離子模式下，m/z271.061 1為[M-H]-，在二級(jí)質(zhì)譜圖中出現(xiàn)的碎片離子峰m/z150.918 0、m/z105.012 1為C環(huán)發(fā)生RDA裂解后所產(chǎn)生的碎片離子，結(jié)合文獻(xiàn)[13]報(bào)道，推測(cè)該化合物為柚皮素。

化合物6的保留時(shí)間為3.76 min，在負(fù)離子模式下，m/z579.170 9為[M-H]-，在二級(jí)質(zhì)譜圖中出現(xiàn)的m/z459.002 1碎片離子由C環(huán)進(jìn)行RDA裂解所產(chǎn)生，m/z271.101 1的碎片離子為糖苷鍵斷裂所產(chǎn)生。結(jié)合文獻(xiàn)[13]報(bào)道，推測(cè)該化合物為柚皮苷。

圖3化合物12(人參皂苷Rd)的二級(jí)質(zhì)譜圖、分子結(jié)構(gòu)及裂解途徑

Fig.3 The MS2spectrum，molecular structure and fragmentation pathway of compound12(ginsenosides Rd)

黃酮類化合物以為柚皮素為例圖示二級(jí)質(zhì)譜圖、分子結(jié)構(gòu)及裂解途徑，見(jiàn)圖4。

圖4化合物5(柚皮素)的二級(jí)質(zhì)譜圖、分子結(jié)構(gòu)及裂解途徑

Fig.4 The MS2spectrum，molecular structure and fragmentation pathway of compound5(naringenin)

3.3酚酸類化學(xué)成分解析 酚酸類化合物在負(fù)離子模式下，共鑒別出3種化合物，具體解析過(guò)程如下：

酚酸類化合物在負(fù)離子模式下以[M-H]-形式存在，一般會(huì)失去1個(gè)羧基產(chǎn)生碎片離子?；衔?的保留時(shí)間為0.69 min，m/z115.003 3為[M-H]-，在二級(jí)質(zhì)譜圖中出現(xiàn)的m/z71.000 2碎片離子為母核失去1個(gè)羧基所產(chǎn)生的碎片離子。結(jié)合文獻(xiàn)[14]報(bào)道，推測(cè)該化合物為富馬酸。

化合物2的保留時(shí)間為1.36 min，在負(fù)離子模式下，m/z153.019 5為[M-H]-，在二級(jí)質(zhì)譜圖中出現(xiàn)的m/z109.001 2碎片離子為母核失去1個(gè)羧基所產(chǎn)生的碎片離子。結(jié)合文獻(xiàn)[14]報(bào)道，推測(cè)該化合物為原兒茶酸。

化合物3的保留時(shí)間為2.37 min，m/z179.034 4為[M-H]-，在二級(jí)質(zhì)譜圖中出現(xiàn)的m/z135.012 3碎片離子為母核失去1個(gè)羧基所產(chǎn)生的碎片離子。結(jié)合文獻(xiàn)[15]報(bào)道，推測(cè)該化合物為咖啡酸。

酚酸類化合物以咖啡酸為例圖示二級(jí)質(zhì)譜圖、分子結(jié)構(gòu)及裂解途徑，見(jiàn)圖5。

圖5化合物3(咖啡酸)的二級(jí)質(zhì)譜圖、分子結(jié)構(gòu)及裂解途徑

Fig.5 The MS2spectrum，molecular structure and fragmentation pathway of compound3(caffeic acid)

4 討論

復(fù)方制劑作用的物質(zhì)基礎(chǔ)、作用機(jī)制及體內(nèi)過(guò)程是中藥研究的核心問(wèn)題。復(fù)方延寄參膠囊是中藥復(fù)方大品種，化學(xué)成分較復(fù)雜，其中什么化合物是在分子層面與“冠狀動(dòng)脈”這個(gè)靶點(diǎn)起作用的體內(nèi)效應(yīng)物質(zhì)，它是由什么物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來(lái)是急待研究的核心問(wèn)題。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS法在負(fù)離子模式下掃描采集數(shù)據(jù)，UNIFI軟件進(jìn)行峰識(shí)別，結(jié)合Massbank和Human Metabolome Database(HMDB)及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)各主要色譜峰進(jìn)行歸屬，從復(fù)方延寄參膠囊甲醇提取物中同時(shí)鑒別出16種化學(xué)成分，包括人參皂苷類10種、黃酮類3種和酚酸類3種。該方法有高分辨率、高效、便捷的特點(diǎn)，可用于快速分析復(fù)方延寄參膠囊的化學(xué)成分。同時(shí)，本文的研究結(jié)果也為復(fù)方延寄參膠囊體內(nèi)效應(yīng)物質(zhì)及其相應(yīng)藥理作用的后續(xù)研究提供依據(jù)。在明晰體內(nèi)效應(yīng)物質(zhì)后，其明確的藥理作用，將使臨床醫(yī)師在該藥物的臨床使用中有的放矢，提高合理用藥率，也為該藥物的質(zhì)量控制提供依據(jù)，提高中藥使用的安全性。

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