新疆假龍膽不同部位中3種環(huán)烯醚萜類成分的含量比較研究

朱丹丹，楊建華,2，居博偉，曹丹丹，許歡歡，吳姍姍，姜湘英，胡君萍*

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，烏魯木齊 830011；3.新疆巴音郭楞蒙古自治州食品藥品檢驗(yàn)所，庫爾勒 841000)

新疆假龍膽Gentianellaturkestanorum(Gand.) Holub為龍膽科假龍膽屬1或2年生草本植物，主要分布在新疆。新疆假龍膽是維吾爾醫(yī)習(xí)用藥材，具有清熱解毒、利濕消腫等功效，維醫(yī)中常用于治療關(guān)節(jié)炎，民間用其全草泡茶治療感冒、發(fā)熱等癥[1-3]。研究顯示，假龍膽屬植物主要含有環(huán)烯醚萜類、黃酮類和三萜類成分[4-5]。課題組前期對10批不同海拔地區(qū)的新疆假龍膽藥材進(jìn)行了活性成分的含量測定[6-7]，發(fā)現(xiàn)各批次藥材均以環(huán)烯醚萜類成分為主，其含量接近或超過2%，其他成分含量較低，提示環(huán)烯醚萜類成分可能是新疆假龍膽發(fā)揮藥效的主要物質(zhì)?，F(xiàn)代藥理研究表明，環(huán)烯醚萜類成分具有抗菌、抗氧化、神經(jīng)保護(hù)、保肝利膽和增強(qiáng)免疫等生物活性[8-13]。目前關(guān)于新疆假龍膽不同極性部位及不同部位中環(huán)烯醚萜類成分分布規(guī)律的研究尚未見報道，為了進(jìn)一步研究新疆假龍膽不同極性部位及不同部位與藥效之間的聯(lián)系，本研究采用經(jīng)典提取分離技術(shù)制備了新疆假龍膽不同極性部位，以獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷為考察指標(biāo)，比較了它們在不同極性部位及不同部位中的含量，為后續(xù)新疆假龍膽的藥理作用活性部位研究及資源合理開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Waters Alliance 2695高效液相色譜儀，Waters 2487紫外檢測器，Empower色譜工作站(沃特世公司)；Sartorius BP211D電子天平(賽多利斯集團(tuán))；KQ-200VDB型雙頻數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；FJY1002-UVF基因研究型超純水機(jī)(青島富勒姆科技有限公司)；1001型冷凍干燥機(jī)(美國Edwards Pirani公司)；HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2試藥 對照品：獐牙菜苦苷(批號20120129)、龍膽苦苷(批號20120114)和獐牙菜苷(批號PN1125SA13)和均購自上海源葉生物科技有限公司；水為超純水；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

新疆假龍膽藥材經(jīng)姜湘英主任藥師鑒定為新疆假龍膽Gentianellaturkestanorum(Gand.) Holub的全草。

2 方法與結(jié)果

2.1新疆假龍膽不同極性部位的制備 稱取新疆假龍膽500 g，剪碎，加入12倍量體積的乙醇，加熱回流提取3次，每次2 h，合并提取液，減壓濃縮至無醇味，冷凍干燥得到新疆假龍膽醇提物。將上述醇提物加適量水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇分別萃取3次，濃縮回收不同極性部位的萃取液，干燥后得到新疆假龍膽石油醚、乙酸乙酯、正丁醇及水部位的浸膏。

2.2溶液的制備

2.2.1混合對照品溶液 取3種對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，得混合對照品儲備液。分別精密移取混合對照品儲備液8 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇稀釋成獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷質(zhì)量濃度分別為161.9，158.4和37.1 mg·L-1的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液

2.2.2.1新疆假龍膽不同極性部位供試品溶液 精密稱取乙醇部位0.1 g，置于具塞三角瓶中，加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲30 min(功率100 W，頻率50 kHz)，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，取上清液過0.22 μm濾膜，作為乙醇部位供試品溶液。石油醚、乙酸乙酯和水部位供試品溶液制備方法同上。正丁醇部位按照上述方法制備經(jīng)超聲后，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，精密吸取溶液1 mL，置于5 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，過0.22 μm濾膜，作為正丁醇部位供試品溶液。

2.2.2.2新疆假龍膽不同部位供試品溶液 將新疆假龍膽不同部位分別粉碎，過8號篩，精密稱取各部位粉末0.1 g，置于具塞三角瓶中，按照2.2.2.1項下方法進(jìn)行制備，即得不同部位供試品溶液。

2.3色譜條件及系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱：Cosmosil packed column 5 C18-PAQ(250 mm × 4.6 mm，5 μm)；柱溫：25 ℃；流動相：甲醇-4 mL·L-1磷酸水溶液(19∶81)；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：242 nm；進(jìn)樣量：10 μL。在選定的色譜條件下，待測成分與相鄰色譜峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于15 000，對照品和樣品色譜圖見圖1。

圖1HPLC圖

A.混合對照品；B.新疆假龍膽醇提物；C.水部位；D.正丁醇部位；E.乙酸乙酯部位；F.石油醚部位；G.根；H.莖；I.花；J.葉；1.獐牙菜苦苷；2.龍膽苦苷；3.獐牙菜苷。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.mixed reference substances；B.alcohol extract ofGentianellaturkestanorum；C.water polarity；D.n-butyl alcohol polarity；E.ethyl acetate polarity；F.petroleum ether polarity；G.root；H.stem；I.flower；J.leaf；1.swertiamarin；2.gentiopicroside；3.sweroside.

2.4線性關(guān)系考察 精密吸取2.2.1項下制備的混合對照品儲備液0.25，1，2，3，5和8 mL，分別置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為系列質(zhì)量濃度對照品溶液。分別吸取上述溶液各10 μL，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以對照品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x)、峰面積為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸，得獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的回歸方程，結(jié)果分別為y=17 790x-31 408，y=8 250x-14 668和y=10 222x-4 718.1。結(jié)果表明，獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的質(zhì)量濃度分別在4.04～129.54(r=0.999 4)，3.96～126.73(r=0.999 3)和0.93～29.70 mg·L-1(r=0.999 5)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一混合對照品溶液(獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷質(zhì)量濃度分別為80.96，79.20 和18.56 mg·L-1)10 μL，按照2.3項色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，測得獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷峰面積的RSD值(n=6)分別為1.37%，1.69%和1.45%。結(jié)果表明，精密度良好。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 分別稱取6份新疆假龍膽乙酸乙酯部位適量，精密稱定，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，測得新疆假龍膽乙酸乙酯部位中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷峰面積的RSD值(n=6)分別為1.74%，1.63%和1.89%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取新疆假龍膽乙酸乙酯部位供試品溶液10L，分別于0，2，4，8，12和24 h進(jìn)樣，測得新疆假龍膽乙酸乙酯部位中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷峰面積的RSD值分別為1.28%，1.71%和1.61%。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取9份新疆假龍膽乙酸乙酯部位0.05 g，分別加入一定量對照品(分別按照相當(dāng)于乙酸乙酯部位的80%，100%和120%量加入獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷對照品)，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10L測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。由表1可知，獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的平均回收率(n=3)分別為99.3%，98.2%和98.9%；97.4%，98.6%和98.3%；97.1%，98.0%和97.5%。

表1加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 The results of recovery tests

(n=3)

2.9樣品測定 分別精密稱取新疆假龍膽醇提物及其各極性部位樣品粉末，按照2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.3項下色譜條件進(jìn)樣10 μL，用外標(biāo)法計算獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的含量，結(jié)果見表2。

表2樣品含量測定結(jié)果

Tab.2 The results of sample content determination

(±s，n=3)

注：-表示未檢出。

3 討論

3.1流動相的選擇 本實(shí)驗(yàn)先后考察了甲醇-水、甲醇-磷酸溶液、乙腈-磷酸溶液系統(tǒng)的分離情況和出峰時間，比較各流動相出峰的峰形、分離度、出峰時間以及拖尾情況，最終選擇甲醇-4 mL·L-1磷酸水溶液系統(tǒng)等度洗脫程序得到的色譜峰峰形較好，分離效果最佳。

3.2檢測波長的選擇 用紫外分光光度計分別測定獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的最大吸收波長分別為238，270和242 nm，其中龍膽苦苷在242 nm處也有較大吸收。為保證被測成分在同一波長下均有較強(qiáng)響應(yīng)，綜合考慮最終設(shè)定在242 nm處檢測獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷。

3.3含量測定結(jié)果分析 新疆假龍膽不同部位中3種化學(xué)成分含量存在明顯差異，含量順序?yàn)榛?葉>根>莖；葉和花中的環(huán)烯醚萜苷含量累積達(dá)2%以上，其中花中能檢出獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐芽菜苷，且獐牙菜苦苷含量為龍膽苦苷含量的2倍，獐芽菜苷含量最低，僅為0.06%，而在其他部位中未檢出獐芽菜苷，這可能與植物代謝有關(guān)；獐牙菜苦苷為葉中的主要成分，含量達(dá)1.90%；根中龍膽苦苷含量較高，是獐牙菜苦苷含量的11倍；莖中獐牙菜苦苷和龍膽苦苷含量均較低。提示新疆假龍膽的葉、花和根具有較高的藥用價值，不同部位中3種環(huán)烯醚萜苷的含量之間的差異，也為后續(xù)分離單體提供理論支撐，或作為研究環(huán)烯醚萜苷主要的制備原料，根據(jù)含量測定結(jié)果可知，維醫(yī)蒙醫(yī)民間藥用新疆假龍膽全草有一定的科學(xué)依據(jù)。新疆假龍膽為1或2年生草本植物，在開花時期采收花和葉可有效的保護(hù)新疆假龍膽，使其在得到充分利用的同時，防止被大量采挖導(dǎo)致野生資源和生態(tài)環(huán)境遭到破壞。新疆假龍膽若能合理地開發(fā)利用也能夠帶動農(nóng)民種植，增加經(jīng)濟(jì)和社會效益。

由于正丁醇中環(huán)烯醚萜類成分含量過高，為減輕色譜柱載樣量，且使各成分均在線性范圍內(nèi)，故將正丁醇部位溶液稀釋5倍，以便測定。新疆假龍膽醇提物及其不同極性部位主要含有獐牙菜苦苷和龍膽苦苷，獐牙菜苷含量均較低；3種活性成分含量存在差異，含量高低順序?yàn)檎〈疾课?醇提物>水部位>乙酸乙酯部位，石油醚部位未能檢出此3種活性成分；課題組前期已測得新疆假龍膽全草3種成分含量累積為2%，新疆假龍膽醇提物含量累積超過5%，與全草相比有所提高[6]，通過初步的萃取技術(shù)，新疆假龍膽正丁醇部位環(huán)烯醚萜類成分的含量超過12%，明顯高于醇提物，說明對醇提物進(jìn)一步萃取是很有必要的，此過程對3種活性成分進(jìn)行了有效富集，也為進(jìn)一步純化分離提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究為后續(xù)篩選新疆假龍膽藥理活性部位，明確3種活性成分含量與藥理活性相關(guān)性提供了參考依據(jù)。

[1] 中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志:六十二卷[M].北京:科學(xué)出版社，1988:313-314.

[2] 新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生廳.維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn):上冊[M].烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社，1993:143-150.

[3] 劉勇民.維吾爾藥志:下冊[M].烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社，1999:892.

[4] 魏茜.尖葉假龍膽化學(xué)成分及含量測定研究[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué)，2014:55-64

[5] Lv Lijuan，Li Minhui.Terpenoids，flavonoids and xanthones fromGentianellaacuta(Gentianaceae)[J].Biochem Syst Ecol，2009，(37):497-500.

[6] 楊建華，薩力塔娜提·熱馬贊，朱丹丹，等.RP-HPLC同時測定新疆假龍膽中5種活性成分含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2015，26(6):842-845.

[7] 阿力同·其米克，姜湘英，郭繼娜.RP-HPLC測定不同海拔新疆假龍膽中3種有效成分的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(24):114-118.

[8] Huang Y J，Lu H，Yu X L，et al.Anti-inflammatory secoiridoid glycosides fromGentianellaazurea[J].Bioorg Med Chem Lett，2014，24(22):5260-5264.

[9] Mihailovic V，Katanic J，Misic D，et al.Hepatoprotective effects of secoiridoid-rich extracts fromGentianacruciataL.against carbon tetrachloride induced liver damage in rats[J].Food Funct，2014，5(8):1795-1803.

[10]王焱，曾文雪，宋小玲，等.龍膽苦苷藥學(xué)研究進(jìn)展及其臨床配伍應(yīng)用[J].西北藥學(xué)雜志，2012，27(5):502-505.

[11]Jaishree V，Badami S.Antioxidant and hepatoprotective effect of swertiamarin fromEnicostemmaaxillareagainst D-galactosamine induced acute liver damage in rats[J].J Ethnopharmacol，2010，130(1):103-106.

[12]Chang Liao W L，Chien C F，Lin L C，et al.Isolation of gentiopicroside fromGentianaeRadixand its pharmacokinetics on liver ischemia/reperfusion rats[J].J Ethnopharmacol，2012，141(2):668-673.

[13]Wu M，Wu P，Liu M，et al.Iridoids fromGentianaloureirii[J].Phytochemistry，2009，(70):746-750.