四味紫草燒傷軟膏的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

夏提古麗·阿不利孜，馬曉玲，劉雪松，魏鴻雁*

(1.新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所，烏魯木齊 830002；2.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830002)

四味紫草燒傷軟膏是由紫草、當(dāng)歸、黃連和冰片4味中藥組成的復(fù)方制劑，具有保護(hù)創(chuàng)面、鎮(zhèn)痛、收濕斂瘡、促進(jìn)結(jié)痂、抗菌抗感染、生肌和消腫等功效[1-2]。本文采用TLC法對(duì)其中的紫草和當(dāng)歸進(jìn)行定性鑒別，采用HPLC法對(duì)黃連中的有效成分鹽酸小檗堿進(jìn)行定量研究，可有效控制四味紫草燒傷軟膏的質(zhì)量。

1 儀器與材料

1.1儀器 LC-2010CHT高效液相色譜(日本島津公司)；Metter AE163電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；DL-1電子萬(wàn)用爐(北京永光明醫(yī)療儀器有限公司)；OSB-2100油浴鍋(上海泉杰儀器有限公司)；KDM可調(diào)控溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司)；薄層層析硅膠G板(青島海洋化工有限公司)。

1.2試藥 左旋紫草素對(duì)照品(批號(hào)110769-201305)，當(dāng)歸對(duì)照藥材(批號(hào)120927-201315，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；四味紫草燒傷軟膏(新疆維吾爾自治區(qū)中藥民族藥研究所制劑室提供，批號(hào)分別為20170201，20170202和20170203)；乙腈和甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。藥材及賦形劑來(lái)源見(jiàn)表1。

表1藥材及賦形劑來(lái)源

Tab.1 The source of samples

名稱批號(hào)產(chǎn)地學(xué)名紫草16072512新疆(本草堂藥業(yè)有限公司)Arnebiaeuchroma(Royle)Johnst15052703新疆(新疆本草堂中藥飲片有限公司)151201內(nèi)蒙(新疆鴻德堂永盛藥業(yè)有限公司)ArnebiaguttataBunge黃連151101湖北(新疆和濟(jì)中藥飲片有限公司)CoptischinensisFranch20130925四川(天馬安徽中藥飲片科技有限公司)150801重慶(新疆鴻德堂永盛藥業(yè)有限公司)當(dāng)歸140915甘肅(天馬安徽中藥飲片科技有限公司)Angelicasinensis(Oliv.)Diels160101甘肅(新疆鴻德堂永盛藥業(yè)有限公司)160721甘肅(安徽匯仁堂中藥飲片有限公司)冰片150901云南林緣香料有限公司Blunmeabalsamif-eraDC150302安徽(天馬安徽中藥飲片科技有限公司)15012029廣東(齊齊哈爾仙鶴中藥飲片廠)蜂蠟20140827天津市福晨化學(xué)試劑廠羊毛脂20150123天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司

2 方法與結(jié)果

2.1性狀鑒別 本品為紫紅色、質(zhì)地均勻、具有良好涂展性的軟膏，氣微香。

2.2TLC鑒別

2.2.1紫草 精密稱定左旋紫草素對(duì)照品12.5 mg，置于25 mL量瓶中，加乙醇定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

取四味紫草燒傷軟膏10 g，加石油醚(60～90 ℃)30 mL，加熱攪拌使溶解，用質(zhì)量濃度為20 g·L-1的氫氧化鈉溶液振搖提取2次，30 mL·次-1，合并提取液，滴加4 mL鹽酸振搖調(diào)至溶液略顯紅色，再加乙醚30 mL提取2次，分取提取液，揮干，殘?jiān)? mL乙醇使溶解，作為供試品溶液。

按照TLC法《中國(guó)藥典》2010年版(一部附錄Ⅵ B)實(shí)驗(yàn)，吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，用甲苯-環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(70∶30∶5∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)、取出、晾干，噴以質(zhì)量濃度為100 g·L-1的氫氧化鉀甲醇溶液,置于紫外燈(365 nm)下進(jìn)行檢視，見(jiàn)圖1。由圖1可知，供試品與對(duì)照品在相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)[3-7]。

2.2.2當(dāng)歸 精密稱定當(dāng)歸對(duì)照藥材0.5 g，加乙醚30 mL，超聲處理15 min，濾過(guò)，濾液60 ℃水浴蒸干至1 mL，作為對(duì)照藥材溶液。

取四味紫草燒傷軟膏15 g，置于圓底燒瓶中，加水80 mL，連接揮發(fā)油測(cè)定器，在測(cè)定器上端加水使其充滿刻度部分，并溢流入燒瓶為止，再加乙酸乙酯1 mL，加熱回流30 min，吸取乙酸乙酯液，揮干，殘?jiān)右掖? mL使溶解，作為供試品溶液。

按照TLC法《中國(guó)藥典》2010年版(一部附錄Ⅵ B)實(shí)驗(yàn)，吸取上述供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯(9∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置于紫外光燈(365 nm)下檢視[8]。供試品在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

2.3鹽酸小檗堿的含量測(cè)定

2.3.1色譜條件與系統(tǒng)適用性 大連江申Century SIL C18-EPS柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-1 mL·L-1磷酸(每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.1 g)(32∶68)為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為345 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。在此色譜條件下，理論板數(shù)按照鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。色譜圖見(jiàn)圖2。

圖1TLC圖

A.紫草：1.左旋紫草素對(duì)照品；2～4.供試品；5.陰性樣品。B.當(dāng)歸：6.當(dāng)歸對(duì)照藥材；7～9.供試品；10.陰性樣品。

Fig.1 TLC chromatograms

A.Arnebiaeuchroma:1.L-shikoninArnebiaeuchromareference substance；2-4.sample；5.negative control.B.Angelicasinensis;6.Angelicasinensisreference substance；7-9.sample 10.negative control.

圖2HPLC圖

A.對(duì)照品；B.樣品；C.陰性樣品；1.鹽酸小檗堿。

Fig.2 HPLC chromatograms

A.reference substance；B.sample；C.negative sample；1.berberine hydrochloride.

2.3.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱定鹽酸小檗堿對(duì)照品10.0 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為100 μg·mL-1的溶液，即得。

2.3.3供試品溶液的制備 精密稱定四味紫草燒傷軟膏5.00 g，加石油醚(60～90 ℃)50 mL，250 W超聲10 min，使其完全溶解，加10 mL·L-1的鹽酸溶液50 mL提取，靜置并收集酸液，提取3次，提取液合并后置于60 ℃水浴中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⒍ㄈ葜?5 mL量瓶中，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取濾液，即得[9-15]。

2.3.4線性范圍考察 精密吸取2.3.2項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液0.5，1，3，5，7和9 μL，注入液相色譜儀，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)(y)、峰面積為橫坐標(biāo)(x)進(jìn)行線性回歸，得鹽酸小檗堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=20 435x+15 948，r=1.000 0。結(jié)果表明，在10.1～181.8 μg·mL-1范圍內(nèi)，鹽酸小檗堿的峰面積與質(zhì)量濃度具有良好的線性關(guān)系。

2.3.5精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.3.2項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，每次5 μL，測(cè)定峰面積RSD值為0.96%(n=5)，結(jié)果表明，精密度良好。

2.3.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.3.6.1日內(nèi)精密度 取同一批號(hào)的樣品分別在同一天的不同時(shí)間(每隔1.5 h)，用含量測(cè)定方法重復(fù)測(cè)定，其RSD值為0.195%。結(jié)果表明，樣品在9 h內(nèi)含量穩(wěn)定。

2.3.6.2日間精密度 取同一批號(hào)樣品分別在不同時(shí)間(連續(xù)6 d)，用含量測(cè)定方法重復(fù)測(cè)定，其RSD值為1.67%。結(jié)果表明，樣品在室溫下6 d內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品共6份，按照2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，結(jié)果鹽酸小檗堿的平均含量為0.789 mg·g-1，RSD值為0.432%。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.3.8回收率測(cè)定 精密稱定供試品2.0 g，共6份，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，分別加入質(zhì)量濃度為0.010 1 mg·mL-1的鹽酸小檗堿對(duì)照品1 mL，按照2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣5 μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算回收率，結(jié)果6個(gè)質(zhì)量濃度的平均回收率為99.41%(n=6)，RSD值為0.58%。見(jiàn)表2。

表2鹽酸小檗堿回收率測(cè)定結(jié)果

Tab.2 Results of recovery test of berberine hydrochloride (n=6)

2.3.9供試品溶液的含量測(cè)定 取3批中試樣品，按照2.3.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定鹽酸小檗堿的含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同批次樣品中鹽酸小檗堿的平均含量為0.771 mg·g-1。

3 討論

四味紫草燒傷軟膏由紫草、黃連、當(dāng)歸、冰片、蜂蠟和麻油等成分組成，具有保護(hù)創(chuàng)面、收濕斂瘡、促進(jìn)結(jié)痂、抗菌抗感染、生肌和消腫等作用。TLC鑒別法是一種操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的方法，在《中國(guó)藥典》和藥品標(biāo)準(zhǔn)中均被廣泛使用。為保證該制劑的療效，本研究按照《中國(guó)藥典》2010年版一部提取方法及薄層層析方法分別對(duì)紫草和當(dāng)歸建立了TLC鑒別方法。

本研究以不同批號(hào)的紫草、黃連、當(dāng)歸和冰片為原料，制備3批四味紫草燒傷軟膏，用HPLC法測(cè)定本制劑中鹽酸小檗堿的含量[16-18]，本文中的方法簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好，為本品的質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究結(jié)果顯示，不同批號(hào)的四味紫草燒傷軟膏中鹽酸小檗堿的含量為0.789 mg·g-1，其中四川產(chǎn)的黃連中鹽酸小檗堿的平均含量較高，這可能與黃連的生長(zhǎng)環(huán)境和采集時(shí)間不同有關(guān)。

[1] 劉麗花，翟來(lái)超，陳天朝，等.黃連紫草膏中地黃、紫草的醇提工藝優(yōu)選[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2015，18(15)：35-37.

[2] 馬曉玲，夏提古麗·阿不利孜，徐小琴，等.八味紫草燒傷膏的鎮(zhèn)痛和創(chuàng)面愈合實(shí)驗(yàn)研究[J].西北藥學(xué)雜志，2017，32(3)：330-332.

[3] 丁葉芳，李西林，柳國(guó)斌，等.紫朱軟膏中紫草的質(zhì)量控制[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2015，22(1)：77-80.

[4] 胡國(guó)冰，張鑒，唐輝，等.紫草配方顆粒中左旋紫草素的定性定量研究[J].食品與藥品，2014，16(1)：25-27.

[5] 姜林，李曉瑾，賈曉光.新疆紫草HPLC指紋圖譜的研究[J].中成藥，2005，27(11):1241-1244.

[6] 彭金年，程庚金生，李丹丹，等.薄層掃描法測(cè)定不同提取方法枇杷葉中齊墩果酸含量[J]．遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，17(6):43-45.

[7] 郭隆鋼，孫帥，謝培山，等.數(shù)碼掃描薄層色譜影像直接測(cè)定黃連提取物中4種生物堿含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2015，26(1):92-95.

[8] 袁杰，劉道芳.接骨靈貼膏質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究[J].中成藥，2016，38(3)：575-578.

[9] 逯雯潔，林鵬程.HPLC法測(cè)定藏藥八昧獐牙菜丸中鹽酸小檗堿的含量[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(1)：50-51.

[10]趙嚴(yán)麗，魏燕珍.高效液相色譜法測(cè)定糖維膠囊中鹽酸小檗堿含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2015，24(4)：45-46.

[11]趙曉妍，周鳳盈，李蘭水.鹽酸小檗堿兩種含量測(cè)定方法的比較[J].中國(guó)藥師，2011，14(11)：1704-1705.

[12]葉建晨.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定芩連膠囊中黃芩苷及鹽酸小檗堿含量[J].中國(guó)藥業(yè)，2013，22(6)：61-63.

[13]郤慶，楊駿，李國(guó)文.HPLC法測(cè)定安心顆粒中鹽酸小檗堿的含量[J].中國(guó)藥師，2014，17(3)：512-514．

[14]盧全德，程璐.高效液相色譜法測(cè)定婦科洗劑中鹽酸小檗堿的含量[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28(19)：1711-1712.

[15]李翔，劉皈陽(yáng)，馬建麗，等.HPLC 法測(cè)定梔子黃柏口服液中鹽酸小檗堿和鹽酸巴馬汀的含量[J].中國(guó)藥師，2013，16(8)：1180-1182.

[16]鐘祥，李應(yīng)東．小檗堿藥理作用研究進(jìn)展[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2012，8(3)：185-186.

[17]李丹丹，江培，楊書(shū)美，等.黃柏的化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].黑龍江醫(yī)藥，2014，27(3)：601-605.

[18]李穎梅，衛(wèi)峰，王志成，等.復(fù)方蒲芩片中鹽酸小檗堿的HPLC法測(cè)定[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2014，45(2)：161-163.