羅漢松種子揮發(fā)油及石油醚提取物GC-MS分析

趙凱麗，黃增瓊

(廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530021)

羅漢松Podocarpusmacrophyllus(Thunb.)D.Don又稱土杉或短葉土杉，為竹柏科植物，主要分布在我國江蘇、浙江、福建、廣東和廣西等地，在廣西北海有較大規(guī)模種植。羅漢松果實由種子和花托組成，文獻記載其具有補腎、益肺、治療血虛面色萎黃和心胃痛的功效[1]。目前，國內(nèi)外對羅漢松葉子的化學(xué)成分進行了較為深入的研究[2-8]。Park H S等[3-5]從羅漢松葉中分離得到羅漢松內(nèi)酯和羅漢松二萜等十幾種化學(xué)成分。近年研究表明，羅漢松果實醇提物具有降血脂、保肝和抗氧化作用；種子醇提物可抑制胃癌細胞的增殖[9-10]。本課題組也報道了羅漢松種子和花托的氨基酸、礦質(zhì)元素以及花托多糖的含量[11-12]。此外，國內(nèi)外鮮有對羅漢松種子化學(xué)成分進行研究的報道。本文采用GC-MS法分析羅漢松種子揮發(fā)油及石油醚提取物的化學(xué)組成，為羅漢松種子的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 WJX-A500高速多功能粉碎機(上海緣沃工貿(mào)有限公司)；EL-204電子天平(瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司)；Varian 300-MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國瓦里安公司)。

1.2試藥 羅漢松種子采自廣西北海，經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室朱丹副教授鑒定為竹柏科植物羅漢松Podocarpusmacrophyllus(Thunb.)D.Don的種子。石油醚(30～60 ℃)和無水硫酸鈉均為分析純。

2 方法

2.1揮發(fā)油的提取 將羅漢松種子自然風干，粉碎，過20目篩，稱取100 g置于圓底燒瓶中，加入1 000 mL去離子水，浸泡0.5 h，保持微沸蒸餾8 h。餾出液以石油醚萃取3次，合并石油醚層，加入無水硫酸鈉脫水，50 ℃減壓回收石油醚，得氣味芳香的無色液體，伴有大量無色針狀結(jié)晶，置于4 ℃冰箱中備用[13]。

2.2石油醚提取物的提取 稱取羅漢松種子粉末40 g，置于索氏提取器中，加入360 mL石油醚提取5 h，減壓回收溶劑，得墨綠色石油醚提取物，置于4 ℃冰箱中備用。

2.3GC-MS分析 色譜條件：VF-5 ms石英毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣：高純氦氣；流速為1.0 mL·min-1；進樣量：1 μL；分流比為10∶1；進樣溫度：250 ℃；升溫程序：50 ℃，保持4 min，以5 ℃·min-1的速率升溫至250 ℃，再以10 ℃·min-1的速率升溫至280 ℃，保持5 min。質(zhì)譜條件：EI離子源；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；倍增器電壓1 250 V；掃描質(zhì)量范圍m/z45～500;圖譜檢索：NIST05質(zhì)譜庫。

3 結(jié)果

3.1揮發(fā)油的化學(xué)組成 羅漢松種子揮發(fā)油提取率為0.16%。GC-MS分析總離子流圖見圖1，經(jīng)質(zhì)譜庫檢索，鑒定出2個化合物：川芎嗪(四甲基吡嗪)和馬鞭草烯酮，相對百分含量分別為97.27%和2.73%。由于川芎嗪含量過高，掩蓋了其他低含量成分的信號峰，導(dǎo)致其他成分無法被鑒定。因此，將該峰屏蔽后進行第2次測定，見圖2。結(jié)果鑒定出43種化合物，見表1，以萜類和芳香族類化合物為主，主要成分分別為(-)-匙葉桉油烯醇(16.89%)、石竹烯氧化物(8.49%)、石竹烯(6.63%)、古巴烯(5.49%)和(S)-馬鞭草烯酮(5.20%)。三甲基吡嗪(0.35%)和高級脂肪酸n-棕櫚酸(0.31%)也被檢測到。

3.2石油醚提取物的化學(xué)組成 羅漢松種子石油醚提取物的提取率為0.93%。經(jīng)GC-MS法分析，共鑒定出53個化合物，見表2，其中萜類36個，酯7個，脂肪酸2個，甾體化合物2個，其他類化合物6個。含量最高的4種成分分別為：海松酸(15.54%)、瓔柏酸甲酯(15.21%)、石竹烯氧化物(10.08%)和古巴烯(9.62%)。此外，揮發(fā)油中的主要成分川芎嗪和(S)-馬鞭草烯酮也被檢測到，相對百分含量分別為1.28%和0.57%。

圖1羅漢松種子揮發(fā)油第1次測定總離子流圖

Fig.1 Ion chromatogram of the first determination of essential oil ofPodocarpusmacrophyllusseeds

圖2羅漢松種子揮發(fā)油第2次測定總離子流圖

Fig.2 Ion chromatogram of the second determination of essential oil ofPodocarpusmacrophyllusseeds

表1羅漢松種子揮發(fā)油GC-MS分析結(jié)果

Tab.1 Analysis results of essential oil ofPodocarpusmacrophyllusseeds by GC-MS

序號保留時間/min英文名稱中文名稱相對含量/%匹配度/%15.74ethylbenzene乙苯0.5179.6210.29trimethylpyrazine三甲基吡嗪0.3593.5311.73benzeneacetaldehyde苯乙醛0.6383.5414.20trans-mentha-2,8-dienol反-薄荷-2,8-二烯醇0.8382.7514.65cis-menth-2,8-diene-1-ol順-薄荷-2,8-二烯-1-醇0.6584.4614.79trans-(-)-pinocarveol反-(-)-松香芹醇3.2089.3714.94cis-verbenol順-馬鞭草烯醇4.0193.0815.084-ethyl-1,3-benzenediol4-乙基-1,3-苯二酚1.0480.1915.223,5-diethyl-2-methylpyrazine3,5-二乙基-2-甲基吡嗪0.4670.61016.00terpinen-4-ol松油烯-4-醇0.8183.61116.21isocarveol異香芹醇1.6074.51216.48myrtenol桃金娘烯醇1.6387.11316.82(S)-verbenone(S)-馬鞭草烯酮5.2093.41417.14cis-carveol順-香芹醇2.8791.81517.53trans-carveol反-香芹醇0.6282.21617.87(S)-carvone(S)-香芹酮0.8189.41719.213-ethyl-4-hydroxy-benzeneamine3-乙基-4-羥基-苯胺0.6275.51820.69α-cubebeneα-蓽澄茄油烯3.5992.31921.47copaene古巴烯5.4994.0

表1(續(xù))羅漢松種子揮發(fā)油GC-MS分析結(jié)果

Tab.1(Continued) Analysis results of essential oil ofPodocarpusmacrophyllusseeds by GC-MS

序號保留時間/min英文名稱中文名稱相對含量/%匹配度/%2021.82β-elemeneβ-欖香烯1.9891.92122.63caryophyllene石竹烯6.6394.62223.55α-caryophylleneα-石竹烯1.6590.32324.011-isopropyl-7-methyl-4-methylene-1,2,3,4,4a,5,6,8a-octahydronaphthalene1-異丙基-7-甲基-4-亞甲基-1,2,3,4,4a,5,6,8a-八氫萘0.2881.12424.19β-cubebeneβ-蓽澄茄油烯0.9080.22524.39α-selineneα-蛇床烯0.9985.82624.55γ-elemeneγ-欖香烯2.9785.22725.08D-cadineneD-蓽澄茄烯1.9392.62826.52(-)-spathulenol(-)-匙葉桉油烯醇16.8994.22926.65caryophylleneoxide石竹烯氧化物8.4993.23027.30humuleneepoxideⅡ蛇麻烯環(huán)氧化物Ⅱ0.7580.53127.69cubenol蓽澄茄油醇0.9276.73227.81alloaromadendreneoxide-(2)別香橙烯氧化物-(2)0.5072.23328.05τ-muurololτ-依蘭油醇3.2584.53428.31α-cadinolα-蓽澄茄醇2.5791.23528.754,4a,5,6,7,8-hexahydro-4,4a-dimethyl-6-(1-methylethenyl)-2(3H)-naphthalenone4,4a,5,6,7,8-六氫-4,4a-二甲基-6-(1-異丙烯基)-2(3H)-萘酮1.3272.43628.905,6,6-trimethyl-5-(3-oxobut-1-enyl)-1-oxaspiro[2.5]octan-4-one5,6,6-三甲基-5-(3-氧代-1-烯基)-1-氧雜螺[2.5]辛烷-4-酮0.6367.73729.50ledenealcohol喇叭烯醇0.7673.43829.83isoaromadendreneepoxide異香橙烯環(huán)氧化物1.0674.83930.05(-)-oplopanone(-)-日本刺參萜酮1.8775.54032.041,3-diphenyl-2-propen-1-one1,3-二苯基-2-丙烯-1-酮0.3479.24133.77sclarene香紫蘇烯0.3474.04234.53n-hexadecanoicacidn-棕櫚酸0.3174.04337.96(1R)-pimaral(1R)-海松醛0.5975.5

表2羅漢松種子石油醚提取物GC-MS分析結(jié)果

Tab.2 Analysis results of petroleum ether extract ofPodocarpusmacrophyllusseeds by GC-MS

序號保留時間/min英文名稱中文名稱相對含量/%匹配度/%14.612,3-butanediol2,3-丁二醇0.2491.129.70(2-methylpropyl)hydrazine2-甲基丙基肼0.3071.039.86α-pineneα-蒎烯1.1692.5410.01methoxyaceticacidethylester甲氧基乙酸乙酯0.4975.6510.97oxirane-2-carboxylicacid,ethylester2,3-環(huán)氧丙酸乙酯0.2971.9614.31D-limoneneD-檸檬烯1.1793.0716.99pyrazine,tetramethyl四甲基吡嗪1.2894.2818.18cis-verbenol 順-馬鞭草烯醇0.8080.9918.82trans-p-mentha-2,8-dienol反-對-薄荷-2,8-二烯醇0.2579.51019.53cis-p-menth-2,8-diene-1-ol順-對-薄荷-2,8-二烯-1-醇0.1878.01119.68trans-pinocarveol反-松香芹醇0.5888.41221.98(E)-3(10)-caren-4-ol(E)-3(10)-蒈烯-4-醇0.3071.51322.35myrtenol桃金娘烯醇0.3382.81422.89(S)-verbenone(S)-馬鞭草烯酮0.5788.41523.47cis-carveol順-香芹醇0.4683.7

表2(續(xù))羅漢松種子石油醚提取物GC-MS分析結(jié)果

Tab.2(Continued) Analysis results of petroleum ether extract ofPodocarpusmacrophyllusseeds by GC-MS

序號保留時間/min英文名稱中文名稱相對含量/%匹配度/%1623.94isopinocarveol異松香芹醇0.1474.31724.61(S)-carvone(S)-香芹酮0.1886.81829.13α-cubebeneα-蓽澄茄油烯3.4595.11930.36copaene古巴烯9.6294.52030.98β-elemeneβ-欖香烯1.9294.12132.20β-caryophylleneβ-石竹烯0.6090.32232.98aromadendren香樹烯0.2983.12334.531,2,4a,5,6,8a-hexahydro-1-isopropyl-4,7-dime-thylnaphthalene1,2,4a,5,6,8a-六氫-1-異丙基-4,7-二甲基萘0.5289.82435.07eudesma-4(14),11-diene4(14),11-桉葉二烯1.6988.82535.37α-selineneα-蛇床烯1.2683.82635.52α-muuroleneα-依蘭油烯0.9992.22736.171-hydroxy-1,7-dimethyl-4-isopropyl-2,7-cyclode-cadiene1-羥基-1,7-二甲基-4-異丙基-2,7-環(huán)癸二烯2.1380.92838.58(-)-spathulenol(-)-匙葉桉油烯醇7.3995.42938.76caryophylleneoxide石竹烯氧化物10.0894.13039.21ledeneoxideⅡ喇叭烯氧化物Ⅱ0.4075.73139.83humuleneepoxideⅡ蛇麻烯環(huán)氧化物Ⅱ1.4188.03240.874,4-dimethyl-tetracyclo[6.3.2.0(2,5).0(1,8)]tridecan-9-ol4,4-二甲基-四環(huán)[6.3.2.0(2,5).0(1,8)]十三烷-9-醇0.4483.03341.57α-cadinolα-蓽澄茄醇1.2485.83442.25isoaromadendreneepoxide異香橙烯環(huán)氧化物0.2973.23544.088,14-cedranoxide8,14-環(huán)氧柏木烷0.3474.73644.40oplopanone日本刺參萜酮0.3084.93748.18tetrahydro-actinidiolide四氫獼猴桃內(nèi)酯0.2765.53848.75phthalicacid,butyloctylester鄰苯二甲酸丁辛酯0.2588.83951.87dibutylphthalate鄰苯二甲酸二丁酯1.2797.34052.18n-hexadecanoicacidn-棕櫚酸2.2789.94154.87(-)-sclareol(-)-香紫蘇醇0.3476.04257.28isopimara-7,15-dien-3-one7,15-異海松二烯-3-酮0.5472.34357.52oleicacid油酸0.5379.84459.64decahydro-5-(hydroxymethyl)-5,8a-dimethyl-γ,2-bis(methylene)-,(1-α,4a-β,5-α,8a-α)-1-naph-thalenepentanol十氫-5-羥甲基-5,8a-二甲基-γ,2-二亞甲基-,(1-α,4a-β,5-α,8a-α)-1-萘戊醇1.7574.94561.47ethylpimarate海松酸乙酯0.3166.94662.10pimaricacid海松酸15.5479.04763.4116-hydroxy-(-)-kauranoicacid16-羥基-(-)-貝殼杉酸2.0663.04863.78methylcommunate瓔柏酸甲酯15.2181.24966.55stevioside甜葉菊苷元0.5069.55066.80abieticacid松香酸0.4876.75168.06estra-5(10)-en-3-one-17-ol,acetate雌二-5(10)-烯-3-酮-17-醇乙酸酯0.3769.05281.4410-nonadecanol10-十九烷醇1.1879.75385.82β-sitosterolβ-谷甾醇1.5782.9

4 討論

本研究采用水蒸氣蒸餾法對羅漢松種子揮發(fā)油進行提取，獲得含大量無色針狀結(jié)晶的揮發(fā)油。結(jié)果表明，該揮發(fā)油中某個成分含量極高，經(jīng)石油醚萃取并回收溶劑即可獲得結(jié)晶。GC-MS鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)油中川芎嗪的相對百分含量高達97.27%，匹配度94.7%，提示該無色針狀結(jié)晶為川芎嗪。川芎嗪是一種生物堿類化合物，其在川芎藥材中的含量僅為0.005%[14]。含有川芎嗪的單方或復(fù)方制劑已廣泛用于冠心病和腦缺血等心腦血管疾病的治療[15-17]。因此，我們認為羅漢松種子中的川芎嗪是羅漢松果實可用于治療心胃痛的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。羅漢松果實中較高的鈣(0.09%)、鎂(0.07%)和天冬氨酸(0.40%)含量可能對其治療心胃痛具有輔助作用[11]。

由于川芎嗪在揮發(fā)油中的含量極高，其他含量相對較低的化學(xué)成分難以被鑒定，因此，實驗排除川芎嗪峰后再次進行GC-MS分析，最終鑒定出43種化合物。其中萜類占70%以上，相對百分含量較高的幾種萜類化合物，如(—)-匙葉桉油烯醇(16.89%)、石竹烯氧化物(8.49%)和古巴烯(5.49%)等均為植物揮發(fā)油中常見的化學(xué)成分。研究發(fā)現(xiàn)[2]，在羅漢松葉精油所鑒定的30種化合物中，僅含貝殼杉烯(23.62%)1種萜類成分，說明羅漢松種子與葉子的揮發(fā)油化學(xué)組成有顯著區(qū)別。值得注意的是，在羅漢松種子石油醚提取物中，我們發(fā)現(xiàn)了16-羥基-(-)-貝殼杉酸(2.06%)，可能是由植物中的貝殼杉烯轉(zhuǎn)化形成的。

在石油醚提取物所鑒定的53個化合物中，有19個化合物與揮發(fā)油中鑒定的成分相同，相同成分主要為萜類化合物。在這53個化合物中，海松酸(15.54%)含量最高。海松酸是松香的化學(xué)成分之一，因其可調(diào)控K+通道并抑制睪酮5α-還原酶而具有潛在治療雄激素依賴性疾病的作用[18-20]。含量較高的石竹烯氧化物(10.08%)和β-石竹烯(0.6%)也是馬纓丹葉子揮發(fā)油的主要成分，兩者具有較好的殺蟲活性[21]。實驗結(jié)果推測，羅漢松種子石油醚提取物可能也具有類似的生物活性。

本研究不僅為提取分離川芎嗪提供了新的藥材來源和方法，還將拓寬羅漢松種子在醫(yī)藥上的用途。下一步，我們將對羅漢松種子的化學(xué)成分及藥理活性進行更深入的研究，為其開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

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