超聲處理大豆分離蛋白與肌原纖維蛋白共混體系乳化性及凝膠性研究

江連洲，張瀟元，潘 悅，李 楊，齊寶坤，綦欣玉，魏嘉禹，王莉涵，王中江

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

大豆分離蛋白(SPI)是一種營養(yǎng)豐富的植物蛋白，其具有的良好功能特性使大豆蛋白在食品工業(yè)中得到了廣泛的發(fā)展與應(yīng)用[1]。肌原纖維蛋白(Myofibrillar protein，MP)是由多種蛋白形成的復(fù)合體，包括肌球蛋白、肌動蛋白、肌動球蛋白和調(diào)節(jié)蛋白等。近幾年來，隨著大豆蛋白經(jīng)濟(jì)價值與功能特性研究的不斷深入，以及消費(fèi)者對肉制品健康需求的增加，大豆分離蛋白已廣泛應(yīng)用于肉制品中。然而，由于低變性SPI的變性溫度通常比低溫肉制品常規(guī)加熱溫度低，極大阻礙了SPI與MP之間的交互作用，導(dǎo)致SPI對MP乳化性與凝膠性的積極作用不明顯。因此，國內(nèi)外學(xué)者開始研究改性后SPI對MP功能性質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過改性的SPI可以不同程度提高M(jìn)P的功能性質(zhì)。Feng等[2-4]曾報道經(jīng)熱處理后的SPI能夠顯著提高肌纖維蛋白凝膠的彈性和強(qiáng)度，但未經(jīng)加熱的天然SPI對肉凝膠沒有較大貢獻(xiàn)。歐陽艷華等[5]研究了經(jīng)酶改性的SPI與雞肉MP復(fù)配后的乳化性和凝膠性，結(jié)果表明，混合蛋白的凝膠性和乳化性明顯改善。

本文系統(tǒng)探討了經(jīng)不同超聲處理的SPI與MP復(fù)合體系的乳化性、流變特征及熱誘導(dǎo)凝膠的質(zhì)構(gòu)性、持水性和作用力，并對其微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。其目的在于討論經(jīng)過怎樣處理的大豆分離蛋白有利于肉蛋白的凝膠特性，從而應(yīng)用于實際低溫肉制品體系中，得以提高大豆分離蛋白在肉制品中的合理應(yīng)用，提高肉制品品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬背部最長肌，哈爾濱家樂福超市；大豆分離蛋白(蛋白含量89.21%)，山東省高唐藍(lán)山集團(tuán)；十二烷基硫酸鈉(SDS)、β-巰基乙醇，美國Sigma公司；葵花籽油，中糧集團(tuán)福臨門；氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，分析純試劑。

1.2 主要儀器設(shè)備

T18型高速分散機(jī)，德國IKA公司；Scientz-IID型超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；ALC-310.3型分析天平，德國艾科勒ACCULAB公司；PHSJ-4A型實驗室pH計，中國上海雷磁公司；AR2000流變儀，英國TA Instrument公司；TA-XT Plus質(zhì)構(gòu)儀，英國Stable Micro Systems公司。

1.3 試驗方法

1.3.1大豆分離蛋白的超聲處理 實驗室提取的大豆分離蛋白用20倍體積的水復(fù)溶，pH調(diào)節(jié)到7.0，將超聲探頭浸入SPI溶液液面以下2cm并位于液面中間，同時將盛放樣品的燒杯置于冰水浴中，在20 Hz選定超聲處理時間和功率進(jìn)行超聲處理(附表)，每超聲5 s，停止超聲5 s，冷凍干燥后得到超聲處理大豆分離蛋白。

附表 超聲處理方法

1.3.2復(fù)合蛋白凝膠的制備 MP∶SPI=4∶1(W/W)，溶解在0.6mol/L NaCl、50mmol/L磷酸鹽緩沖溶液中，總蛋白濃度為40mg/mL，室溫下攪拌90min，即得MP-SPI復(fù)合蛋白。復(fù)合蛋白在80℃條件下水浴30min制備凝膠，4℃隔夜。

1.3.3乳化性測定 用0.1mol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖溶液配制100mL、0.1g/mL的混合蛋白懸浮液，其中，MP∶SPI=4∶1(W/W)。向勻漿機(jī)中加入30mL蛋白懸浮液、10mL葵花籽油，在20 000r/min的條件下得到乳濁液，在0min與10min時從底部吸取100μL加入10mL質(zhì)量濃度為0.1g/mL的SDS溶液中，測定波長為500nm時的吸光度(取3次測定的平均值)，乳化性的計算公式為式(1)、(2)：

乳化活性(EAI)=A0×100

(1)

乳化穩(wěn)定性(ESI)=(A10/A0)×100

(2)

式(1)、(2)中，A0：0min的吸光值；A10：10min 的吸光值

1.3.4凝膠質(zhì)構(gòu)性的測定 將制備的復(fù)合蛋白凝膠在4℃冰箱中過夜后，利用質(zhì)構(gòu)儀測定凝膠硬度，測試前先將凝膠在25℃條件下水浴1 h。設(shè)定的主要參數(shù)是：探頭類型為P/0.5、測前速度為1.0mm/s、測定速度0.5mm/s、測定距離為5.0mm、測后速度為1.0mm/s、觸發(fā)類型為自動、觸發(fā)力為5g，數(shù)據(jù)獲得速度為200pps。

1.3.5凝膠持水性的測定 制備的復(fù)合蛋白凝膠在 4℃冰箱中過夜后，取凝膠塊放入50mL的離心管中，離心(10 000g、15min、4℃)。除去水后，將離心管倒放在鋪有吸水毛巾的桌面上，15min后稱重[6-7]。

(3)

1.3.6流變性的測定 流變學(xué)性質(zhì)測定采用剪切速率掃描模式[8]。將經(jīng)過不同方式制備的大豆蛋白-磷脂酰膽堿納米乳液加到流變儀平板上，流變儀平板直徑為40mm，探頭型號及尺寸：pp為20mm、板間距為0.5mm。采用石蠟油對兩平行板間的縫隙封口，防止水分蒸發(fā)。測定參數(shù)：初始溫度25℃，以5℃/min升溫速率升溫至90℃后保溫20min，之后以5℃/min降溫速率降溫至25℃。角頻率為0.63 rad/s，固定形變0.01，記錄下彈性模量G′數(shù)值的變化。

1.3.7化學(xué)作用力的測定 復(fù)合蛋白凝膠的作用力根據(jù)Jiang等[9]的方法進(jìn)行測定。2g凝膠樣品溶解在18mL不同的溶解液中，然后將混合溶液于80℃加熱30min，冷卻到室溫，5 000g離心15min。經(jīng)溶解液處理后提取的蛋白含量被用來表明凝膠中的主要作用力。溶解液如下：8mol/L尿素、50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)(氫鍵)；0.5% SDS、50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)(疏水交互作用)；0.25% β-巰基乙醇、50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)(二硫鍵)。

1.3.8掃描電鏡 將真空冷凍干燥后的粉末充氮氣密封、避光儲藏，測量時首先用導(dǎo)電雙面膠將凍干粉末固定在金屬樣品平臺上，輕吹去多余的粉末，置于離子濺射儀的樣品艙中，在15mA的電流下噴金90 s，樣品取出后，裝入掃描電子顯微鏡(15 kV)觀察室，進(jìn)行觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

單項實驗重復(fù)3次。用SAS 8.12進(jìn)行差異顯著性(P<0.05)分析。采用Origin9.1軟件進(jìn)行圖表處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲處理復(fù)合蛋白體系乳化性

如圖1和2所示，與天然SPI與MP復(fù)合體系乳化性(EAI 8.97m2/g，ESI 66.7%)相比，經(jīng)超聲處理后的SPI與MP復(fù)合體系乳化性顯著提高。而且經(jīng)高功率、長時處理的SPI與MP復(fù)合體系乳化性最好，乳化活性和乳化穩(wěn)定性分別為18.25m2/g和78.88%。

超聲波能產(chǎn)生空穴效應(yīng)、機(jī)械剪切作用以及熱作用，能夠破壞大豆分離蛋白分子中維持高級結(jié)構(gòu)的次級鍵，使肽鏈變得疏松，在復(fù)合蛋白乳化均質(zhì)過程中，利于吸附在油—水界面，提高SPI的溶解度[10-11]，促進(jìn)了其與MP能更好地溶解在緩沖液中，提高蛋白質(zhì)—水之間的作用，提高復(fù)合體系的乳化性。另外，SPI經(jīng)超聲處理使更多疏水基團(tuán)暴露，降低SPI表面張力，在與MP復(fù)合乳化均質(zhì)過程中，使更多的蛋白質(zhì)吸附在氣/水界面上，降低蛋白膜的粘性度和剛性，提高乳化活性。SPI經(jīng)超聲處理后，蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)會被破壞掉，這有助于形成足夠的界面來穩(wěn)定油滴，所以MP與SPI復(fù)合體系的乳化穩(wěn)定性增強(qiáng)[12]。

2.2 超聲處理復(fù)合蛋白體系質(zhì)構(gòu)性

圖3和圖4表明，SPI經(jīng)超聲處理后能夠改善SPI與MP復(fù)合凝膠的硬度和彈性，且經(jīng)高功率超聲處理的SPI與MP復(fù)合凝膠硬度及彈性值提高顯著(P<0.05)。與MP-NSPI凝膠相比，凝膠2～5號樣品的硬度分別提高了3.1%、8%、17.6%和21.5%，彈性的變化趨勢與硬度的變化趨勢相同，其中經(jīng)功率400 W、超聲20min的SPI與MP凝膠的彈性最大，為0.88mm。

超聲波通過在固體顆粒的表面產(chǎn)生高速微射流，對固體顆粒表面進(jìn)行剝離、凹蝕和粉碎，從而產(chǎn)生新的活性表面，提高蛋白質(zhì)表面的親水性[13]。SPI經(jīng)超聲處理后，疏水肽的分子數(shù)目增多，疏水基團(tuán)暴露增加了蛋白質(zhì)的疏水部分，促進(jìn)膠束的形成[14]，進(jìn)而影響MP與SPI復(fù)合凝膠的凝膠性。超聲功率增加后聲能密度增大及聲能轉(zhuǎn)化為更多的化學(xué)能和物理能，SPI受機(jī)械剪切、攪拌空化作用增強(qiáng)。增加超聲功率還會加快大豆蛋白構(gòu)型的破壞，蛋白分子展開暴露出更多的疏水基團(tuán)，進(jìn)而提高了蛋白質(zhì)的表面疏水性，降低了表面張力。這樣，蛋白質(zhì)—水之間的相互作用及蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)作用增強(qiáng)，將間隙中的水分鎖定在凝膠體系的同時網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)會更加緊密，從而提高了SPI與MP復(fù)合凝膠的硬度及彈性。

2.3 超聲處理復(fù)合蛋白體系持水性

如圖5所示，超聲處理后的SPI與MP復(fù)合凝膠持水性顯著提高(P<0.05)。與天然SPI與MP復(fù)合凝膠持水性53.68%相比，MP-USPI(200W、10min)、MP-USPI(200W、20min)、MP-USPI(400W、10min)和MP-USPI(400W、20min)凝膠，持水性分別提高了6.91%、11.96%、23.69%和28.05%。這可能是因為SPI經(jīng)超聲處理后，能顯著提高大豆分離蛋白的溶解性[15-16]。MP也是鹽溶蛋白，SPI溶解性提高，使得溶解于溶劑中的總蛋白含量提高，加強(qiáng)蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)—水之間的作用，熱誘導(dǎo)凝膠形成過程中能形成比較均勻的凝膠結(jié)構(gòu)。已有研究表明，凝膠的微觀結(jié)構(gòu)與凝膠持水性密切相關(guān)。通常情況下蛋白質(zhì)疏水區(qū)域一般在蛋白質(zhì)分子內(nèi)部，超聲處理的SPI能將各種疏水基團(tuán)接到蛋白質(zhì)分子上，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，形成可溶性蛋白聚集物，粒度及不溶蛋白的聚合程度降低。在MP與SPI復(fù)合蛋白凝膠形成過程中，SPI粒度的減小有益于產(chǎn)生更多蛋白質(zhì)-水之間的相互作用，提高復(fù)合蛋白凝膠的持水性。

2.4 超聲處理復(fù)合蛋白體系流變性

由圖6可知，隨著溫度的上升(20～80℃)，所有經(jīng)過超聲處理的SPI與MP混合蛋白的彈性模量G’明顯高于未經(jīng)超聲處理的SPI與MP復(fù)合體系的彈性模量G’。在超聲作用下，微流束作用和空穴效應(yīng)促使分子運(yùn)動速度加快，降低蛋白聚集程度，使SPI分子鏈展開，進(jìn)而改變MP-SPI的流變性。

由圖6可見，G’的變化呈現(xiàn)出雙峰值，代表熱誘導(dǎo)凝膠形成過程中經(jīng)歷兩個熱變性階段，其中一個組分先發(fā)生變性，另一個組分需要在更高的溫度下才發(fā)生變性[17]。有學(xué)者對稀溶液中肌球蛋白分子的熱誘導(dǎo)凝膠形成機(jī)制進(jìn)行了研究，認(rèn)為熱誘導(dǎo)凝膠的形成機(jī)制是肌球蛋白分子的頭—頭的凝聚、頭—尾的凝聚和尾—尾的凝聚[18]，因此就會引起兩個峰值的出現(xiàn)。結(jié)果還表明，SPI經(jīng)高功率超聲處理后與MP復(fù)合最終的G’增加值更大，這可能是因為聲能密度增大，并且能將聲能轉(zhuǎn)化為更多的化學(xué)能和物理能，SPI受機(jī)械剪切、攪拌空化作用增強(qiáng)，使得SPI變性程度越大，與MP能形成更好的凝膠，因此儲能模量G’越大。此外，高功率超聲處理使蛋白分子展開，暴露更多的疏水基團(tuán)，能夠提高SPI的表面疏水性，增強(qiáng)SPI與MP之間的疏水交互作用，使彈性增加，表現(xiàn)為高的G’值。

2.5 超聲處理復(fù)合體系凝膠形成過程中的作用力

由圖7可知，經(jīng)β-巰基乙醇溶解后的蛋白含量無顯著變化，經(jīng)尿素和SDS溶解后的蛋白含量隨著超聲功率和超聲時間的提高發(fā)生顯著變化(P<0.05)，并且還發(fā)現(xiàn)高功率的影響更為顯著。說明經(jīng)超聲處理的SPI對復(fù)合凝膠的二硫鍵影響不顯著，但對復(fù)合凝膠的氫鍵和疏水作用影響顯著。還可發(fā)現(xiàn)，不論是未超聲的SPI與MP的復(fù)合凝膠，還是經(jīng)超聲處理的SPI與MP復(fù)合凝膠，氫鍵和疏水交互作用都是穩(wěn)定/形成凝膠最重要的力，二硫鍵也參與凝膠的形成，但不是穩(wěn)定/形成凝膠最主要的力。為此可以推斷不論超聲與否，疏水交互作用、氫鍵和二硫鍵都對SPI與MP凝膠結(jié)構(gòu)的維系起了作用，并且疏水交互作用和氫鍵作用遠(yuǎn)高于二硫鍵的作用。

超聲作用將疏水基團(tuán)暴露至蛋白表面[19]，疏水相互作用在凝膠的形成過程中起重要作用[20]，特別是在熱聚集的時候能夠形成更好的蛋白-蛋白聚合物，提高SPI與MP的交互作用，表現(xiàn)為疏水交互作用的增強(qiáng)。Tian等[21]推斷超聲處理產(chǎn)生的空穴效應(yīng)能增大水和空氣之間的間距，從而使蛋白分子環(huán)境發(fā)生變化，降低氫鍵和疏水相互作用。本文SPI經(jīng)超聲空穴效應(yīng)可能也會削弱氫鍵和疏水相互作用。SPI分子內(nèi)/間氫鍵的減少，在隨后的熱誘導(dǎo)MP-SPI形成過程中，會繼續(xù)減少，表現(xiàn)為用尿素提取的蛋白含量減少。而SPI疏水交互作用的減弱，能引起大豆分離蛋白溶液的游離巰基含量、表面疏水性和溶解性的增加，這會引起MP與SPI疏水交互作用的增強(qiáng)，使經(jīng)SDS提取的蛋白含量顯著提高。SPI蛋白分子間的非共價作用減少可能轉(zhuǎn)化為靜電相互作用，從而影響MP-SPI凝膠的持水性。已有研究表明，超聲波導(dǎo)致溶解性和表面疏水性同時增加的現(xiàn)象，可能是蛋白粒度減小、其他分子相互作用力減弱的結(jié)果[22]。

2.6 超聲處理復(fù)合體系凝膠觀結(jié)構(gòu)觀察

通過對超聲處理的SPI與MP復(fù)合蛋白凝膠掃描電鏡圖8觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過超聲波處理的凝膠空間結(jié)構(gòu)與未處理的樣品有顯著差異。MP-NSPI凝膠(圖a)的SPI呈不規(guī)則形狀充填在混合體系中，凝膠結(jié)構(gòu)粗糙，有明顯的斷層感，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的交聯(lián)。經(jīng)200W超聲的SPI與MP復(fù)合凝膠(圖b和c)能看到交聯(lián)現(xiàn)象，生成了不規(guī)則、大的孔洞。經(jīng)高場強(qiáng)超聲的SPI與MP復(fù)合凝膠(圖d和e)能觀察到明顯的粗絲、細(xì)絲交聯(lián)現(xiàn)象，結(jié)構(gòu)變得更加致密和均勻，不規(guī)則的孔洞變小。蛋白分子的大小和形狀能影響凝膠的微觀結(jié)構(gòu)[23]，SPI經(jīng)超聲作用會減小其粒度，增強(qiáng)蛋白質(zhì)—蛋白質(zhì)的相互作用，影響最終MP-SPI復(fù)合凝膠的微觀結(jié)構(gòu)。而且超聲導(dǎo)致可溶性蛋白聚合物的形成[24]，這種可溶性蛋白聚合物，在形成熱凝膠時可能轉(zhuǎn)變?yōu)殡y溶蛋白聚合物并有利于與MP通過疏水交互結(jié)合，起到使空間結(jié)構(gòu)更加均一、致密的作用。Madadlou等[25]指出蛋白粒徑減小后，再發(fā)生聚合可以使結(jié)合更緊密，空間結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，凝膠質(zhì)構(gòu)性更強(qiáng)。

3 結(jié)論

通過對超聲處理MP-SPI復(fù)合體系乳化性質(zhì)、凝膠性(持水性、流變性、質(zhì)構(gòu)性)的測定并對凝膠微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察可知：SPI經(jīng)過10/20min、200/400 W超聲處理后會影響MP-SPI復(fù)合體系的乳化性、凝膠性。其中MP-USPI(400W、20min)復(fù)合體系乳化性及凝膠性最好，EAI和ESI分別為18.25m2/g 和78.88%；持水性提高了28.05%；硬度提高了21.5%；彈性為0.88mm。凝膠結(jié)構(gòu)變得致密、均勻，不規(guī)則孔洞變小。隨著SPI變性程度的升高，氫鍵都有下降趨勢，疏水交互作用增加，二硫鍵變化不顯著?！?/p>

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