《蜂膠中楊樹膠的檢測(cè)方法 高效液相色譜法》國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T34782-2017）

前 言

本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。

本標(biāo)準(zhǔn)由中華供銷合作總社提出。

本標(biāo)準(zhǔn)由全國蜂產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化工作組（S A C/S WG2）歸口。

本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：浙江大學(xué)、中國蜂產(chǎn)品協(xié)會(huì)、農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（北京）、江山福賜德蜂業(yè)科技開發(fā)有限公司、廈門思健生物科技有限公司、上海滬郊蜂業(yè)聯(lián)合社有限公司。

本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：胡福良、張翠平、鄭火青、呂澤田、李熠、徐水榮、顏鑒翔、孫德官。

引 言

本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)提請(qǐng)注意，聲明符合本文件時(shí)，可能涉及到第4～9章與以水楊苷和鄰苯二酚為指標(biāo)鑒別楊樹膠的原理及檢測(cè)方法相關(guān)的專利（Z L201010180675.0和Z L201310721079.2）的使用。

本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)對(duì)于該專利的真實(shí)性、有效性和范圍無任何立場(chǎng)。

該專利持有人已向本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)保證，他愿意同任何申請(qǐng)人在合理且無歧視的條款和條件下，就專利授權(quán)許可進(jìn)行談判。該專利持有人的聲明已在本文的發(fā)布機(jī)構(gòu)備案。相關(guān)信息可以通過以下聯(lián)系方式獲得：

專利持有人：浙江大學(xué)。

地址：浙江省杭州市西湖區(qū)余杭塘路866號(hào)。

請(qǐng)注意除上述專利外，本文件的某些內(nèi)容仍可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別這些專利的責(zé)任。

蜂膠中楊樹膠的檢測(cè)方法反相高效液相色譜法

1 范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了蜂膠中是否含有楊樹膠的反相高效液相色譜鑒別方法的原理、試劑、材料、儀器、設(shè)備和試驗(yàn)方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于蜂膠及蜂膠乙醇提取物中楊樹膠的檢測(cè)。

2 規(guī)范性引用文件

下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。

GB/T6682 分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

3 術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。

3.1 蜂膠 propolis

工蜂采集樹脂等植物分泌物與其上顎腺、蠟腺分泌物等混合形成的膠粘性物質(zhì)。

3.2 蜂膠乙醇提取物 ethanol extracted propolis

乙醇萃取蜂膠后得到的物質(zhì)。

3.3 楊樹膠 extracted populus buds, leaves or barks

楊屬（Populus）植物的芽、葉子或樹皮等組織經(jīng)人工熬制加工，再經(jīng)乙醇提取而成的提取物。

3.4 楊樹型蜂膠 poplar type propolis

楊屬（Populus）為主要植物來源的蜂膠。

4 原理

水楊苷和鄰苯二酚廣泛存在于楊屬和柳屬植物的芽、葉子和樹皮中。當(dāng)這些芽、葉子和樹皮經(jīng)過煎煮之后，水楊苷和鄰苯二酚依然存在。而蜂膠中并不存在水楊苷和鄰苯二酚。因此可以作為蜂膠中是否摻有楊樹膠的鑒別指標(biāo)。

試樣經(jīng)75%乙醇提取后，用配有紫外檢測(cè)器的高效液相色譜儀在213 n m處檢測(cè)水楊苷和鄰苯二酚的含量，從而判斷蜂膠中是否含有楊樹膠。

5 試劑和材料

實(shí)驗(yàn)室用水應(yīng)符合GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。除非另有規(guī)定，所有試劑均為分析純。

5.1 甲醇：色譜純。

5.2 乙腈：色譜純。

5.3 乙醇。

5.4 磷酸。

5.5 水楊苷標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%。

5.6 鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99%。

5.7 0.5%磷酸（5.4）溶液：量取5 m L 磷酸，用水定容至1 L。

5.8 標(biāo)準(zhǔn)貯備液：準(zhǔn)確稱取水楊苷（5.5）和鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品（5.6）各10 m g，分別用甲醇溶液（5.1）配制成1.0 m g/m L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于4℃冰箱保存，保持期3個(gè)月。

5.9 標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取適量的水楊苷和鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)貯備液（5.8），用甲醇溶液（5.1）分別稀釋成水楊苷濃度為0.005 m g/m L、0.01 m g/m L、0.02 m g/ m L、0.04 m g/m L和0.06 m g/m L五個(gè)濃度，鄰苯二酚濃度為0.005 m g/m L、0.01 m g/m L、0.02 m g/m L、0.04 m g/m L和0.06 m g/m L五個(gè)濃度，現(xiàn)用現(xiàn)配。

5.10 濾膜：0.45 μm，有機(jī)系。

6 儀器和設(shè)備

6.1 高效液相色譜儀：配有紫外檢測(cè)器。

6.2 粉碎機(jī)。

6.3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

6.4 超聲波清洗器。

7 樣品的取樣及預(yù)處理

從被檢樣品的不同部位均勻取樣50 g，冷凍，粉碎，混勻，作為備檢樣品。

8 試驗(yàn)方法

8.1 供試樣品溶液的制備

稱取2 g蜂膠試樣，用75%乙醇超聲波提取30 m i n，料液比為1︰15 (質(zhì)量∶體積)，反復(fù)提取3次，合并濾液，離心過濾后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，或者稱取1 g蜂膠乙醇提取物試樣，然后用75%乙醇超聲溶解定容至50 m L，取上清液，0.45 μm濾膜過濾，供液相色譜測(cè)定。

8.2 色譜條件

色譜柱：S e p a x H P-C18，柱長150 mm，內(nèi)徑4.6 mm，粒度5 μm；或性能相當(dāng)?shù)纳V柱。

流動(dòng)相流速：1 m L/m i n。

梯度洗脫，洗脫程序參見附錄A 表A.1。

檢測(cè)波長：213 n m。

柱溫：30℃。

進(jìn)樣量：5 μL。

8.3 測(cè)定

取5 μL樣品溶液（8.1）、水楊苷和鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)工作液（5.9）分別進(jìn)樣分析。

水楊苷標(biāo)準(zhǔn)品、鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品、楊樹型蜂膠、楊樹膠的色譜圖分別參見附錄B圖B.1，B.2，B.3和B.4。

8.4 結(jié)果計(jì)算

試樣中水楊苷或鄰苯二酚含量（X）以毫克每克（m g/g）表示，按式（1）計(jì)算：

式中：

CS—水楊苷或鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位為毫克每毫升（m g/m L）；

V—試樣最終定容體積，單位為毫升（m L）；

AS—水楊苷或鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的峰高或峰面積；

A—試樣溶液對(duì)應(yīng)的峰高或峰面積；

m—樣品質(zhì)量，單位為克（g）。

將符合重復(fù)性要求的兩個(gè)獨(dú)立測(cè)定值的算術(shù)平均值作為測(cè)定結(jié)果（m g/g），保留兩位有效數(shù)字。平行試驗(yàn)相對(duì)偏差不得超過2.0%。

8.5 結(jié)果判定

本方法所檢測(cè)的水楊苷和鄰苯二酚為楊樹膠中含有而蜂膠中不含有的物質(zhì)。如果待測(cè)樣品中檢測(cè)不到水楊苷，且鄰苯二酚檢測(cè)濃度在蜂膠乙醇提取物中低于0.21 m g/g，或在蜂膠原料樣品中低于0.12 m g/g，則該樣品為未檢出楊樹膠的樣品；如果待測(cè)樣品中檢測(cè)不到水楊苷，但蜂膠乙醇提取物樣品中鄰苯二酚檢測(cè)濃度大于0.21 m g/g，或待測(cè)原料蜂膠樣品中鄰苯二酚檢測(cè)濃度大于0.12 m g/g，則該樣品判定為含有楊樹膠的樣品；如果待測(cè)樣品中檢測(cè)到水楊苷，則該樣品判定為含有楊樹膠的樣品。

9 檢測(cè)限

本標(biāo)準(zhǔn)在進(jìn)樣量為5 μL 時(shí)，蜂膠乙醇提取物中水楊苷的最低檢測(cè)限為0.065 m g/g，鄰苯二酚的最低檢測(cè)限為0.063 m g/g；蜂膠原料中水楊苷的最低檢測(cè)限為0.032 m g/g，鄰苯二酚的最低檢測(cè)限為0.031 m g/g。

附錄A（資料性附錄）

高效液相色譜梯度洗脫程序

高效液相色譜梯度洗脫程序見表A.1。

表A.1 高效液相色譜法梯度洗脫程序

附錄B（資料性附錄）

水楊苷標(biāo)準(zhǔn)品、鄰苯二酚標(biāo)準(zhǔn)品、楊樹型蜂膠、楊樹膠的色譜圖

水楊苷（標(biāo)準(zhǔn)品）色譜圖見B.1：

B.1 水楊苷（標(biāo)準(zhǔn)品）色譜圖

鄰苯二酚（標(biāo)準(zhǔn)品）色譜圖見B.2：

B.2 鄰苯二酚（標(biāo)準(zhǔn)品）色譜圖

楊樹型蜂膠色譜圖見B.3：

B.3 楊樹型蜂膠色譜圖

楊樹膠色譜圖見B.4：

B.4 楊樹膠色譜圖