24味中草藥對舌鰨源嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果

王洪彬 ，李永慧 ，朱利霞 ，吳同壘 ，張志強(qiáng) ，高桂生 ，史秋梅

（1.河北科技師范學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066604；2.秦皇島第二醫(yī)院，河北 秦皇島 066604）

舌鰨Cynoglossus sp.營養(yǎng)豐富，肉質(zhì)細(xì)膩、味道鮮美，廣受消費(fèi)者喜愛，是名貴的海水養(yǎng)殖魚類之一。隨著海水養(yǎng)殖舌鰨規(guī)模的擴(kuò)大，各種細(xì)菌性疾病也隨之而來，其中由嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila引起的細(xì)菌病最為嚴(yán)重。嗜水氣單胞菌是一種常見的條件致病菌[1,2]，能夠引起多種淡水魚、蛙、哺乳動(dòng)物以及海水養(yǎng)殖魚類的敗血癥、皮膚潰瘍、腹瀉等疾病[3]。有資料顯示，該菌還是一種嚴(yán)重的“人-畜-魚”共患菌[4]，研究該菌具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義。

近年來，由于魚類養(yǎng)殖中大量使用、濫用抗生素和化學(xué)藥物，導(dǎo)致水體養(yǎng)殖環(huán)境惡化，也產(chǎn)生了耐藥性菌株，水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類免疫力下降，抗病能力減弱，甚至嚴(yán)重威脅人類的健康和食品安全。中草藥取材方便、價(jià)格低廉，含多種生物活性物質(zhì)，如有機(jī)酸類、生物堿類等，可調(diào)節(jié)水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類的免疫力，能夠增強(qiáng)魚類的抗菌、抗病能力等[5]，越來越被人們所接受。從中草藥中篩選出具有更強(qiáng)抗菌能力的藥物受到了極大的重視[6]。本試驗(yàn)選取板藍(lán)根、連翹、訶子等24味中草藥，采用水提法提取中藥材有效成分，測定這24味中草藥水提物對舌鰨源嗜水氣單胞菌的抑菌效果，為進(jìn)一步篩選出具有明顯抑菌作用的中草藥和臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)菌株：舌鰨源嗜水氣單胞菌為本實(shí)驗(yàn)室提供，編號(hào)為A.H QHD-1。

24種中草藥是：訶子、蘇木、艾葉、石榴皮、厚樸、蒲公英、馬齒莧、知母、決明子、桔梗、龍膽草、青皮、苦參、郁金香、香附、防風(fēng)、荊芥、黃柏、連翹、黃芩、夏枯草、紫花地丁、板藍(lán)根和女貞子，購自秦皇島民樂醫(yī)藥。營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

試驗(yàn)儀器有：G1040WS-立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器，致微（廈門）儀器有限公司；無菌工作臺(tái)，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司；冰箱，青島海爾特種電冰箱有限公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；常規(guī)試劑與儀器均等由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)菌株菌液的制備

從-80℃冰箱中取出舌鰨源嗜水氣單胞菌，接種于普通的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)過夜。無菌挑取嗜水氣單胞菌單個(gè)菌落，接種于含有4mL營養(yǎng)肉湯的試管培養(yǎng)基中，置于28℃180r/min搖床，搖菌12h。用平板菌落計(jì)數(shù)法確定菌液濃度，使菌液最終稀釋至1×108cfu/mL。

1.2.2 單味中草藥藥液制備

根據(jù)參考文獻(xiàn)[7]中報(bào)道的水提法，并略加改動(dòng)，提取連翹、知母、訶子等24味中草藥有效成分。先稱取定量的中草藥原料，除去雜質(zhì)，清洗，干燥。粉碎后，每種中草藥稱取40g倒入燒杯中，加入400mL水浸泡1h。然后煎煮，邊煮邊攪拌，連煮2次，冷卻并過濾，離心后濃縮至40mL，使藥液終濃度為1g/mL，分裝后121℃滅菌10min，分裝并置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 中草藥對嗜水氣單胞菌的體外抑菌效果Tab.1 The in vitro bacteriostatic effects of Chinese herbal medicines on Aeromonas hydrophila

1.2.3 中草藥體外抑菌圈直徑的測定

[8]中的瓊脂平板打孔法測定。抑菌圈直徑≥20mm為極敏，20mm＞抑菌直徑≥15mm為高敏，15mm＞抑菌圈直徑≥10mm為中敏，10mm以下為低敏[9]。

1.2.4 中草藥最小抑菌濃度（MIC）的測定

按參考文獻(xiàn)[10]略加改動(dòng)，用試管二倍稀釋法測定MIC。先將11只試管標(biāo)號(hào)1～11，每管加入2mL 2×的營養(yǎng)肉湯；在第2個(gè)管中加入2mL的藥液（1g/mL），混合均勻后吸取2mL到第3管里，依次重復(fù)直到第9管，從第9管吸取2mL到第11管混合均勻后棄去2mL，第10管不加藥作為陽性對照；第1～10管各加入10μL菌液（菌液濃度1×108cfu/mL），第11管不接菌為陰性對照。每種藥物3個(gè)重復(fù)，28℃培養(yǎng)24h。利用平板分區(qū)劃線法，無菌棉簽蘸取不同稀釋度的培養(yǎng)液涂板，28℃培養(yǎng)12h后觀察結(jié)果。無菌生長時(shí)的藥物濃度為該藥的MIC。

表2 不同中草藥對嗜水氣單胞菌的MICTab.2 The minimum inhibitory concentration （MIC）of different Chinese herbal medicines on Aeromonas hydrophila

2 結(jié)果與分析

由表1可知：舌鰨源嗜水氣單胞菌對訶子、蘇木、夏枯草、青皮這4種中草藥極敏感；對黃芩、板藍(lán)根、厚樸、紫花地丁高度敏感；對女貞子、苦參、荊芥中度敏感；對黃柏、龍膽草、知母、防風(fēng)、決明子、郁金香、馬齒莧、艾葉、石榴皮、桔梗低敏感。建議在水產(chǎn)養(yǎng)殖中聯(lián)合使用訶子和青皮，以達(dá)到更好的治療效果。

由表2可知：訶子和夏枯草對舌鰨源嗜水氣單胞菌的MIC為31.25mg/mL,；蘇木、青皮對該菌的MIC為62.5 mg/mL；紫花地丁、厚樸對該菌的MIC為125 mg/mL；黃芩、板藍(lán)根、女貞子、蒲公英對該菌的MIC為250 mg/mL；香附、苦參、荊芥對該菌的MIC為500 mg/mL；黃柏、龍膽草等中草藥沒有抑菌效果。每味中草藥對舌鰨嗜水氣單胞菌的MIC不同，生產(chǎn)中可以據(jù)此合理調(diào)整，減少藥物的濫用和浪費(fèi)，提高經(jīng)濟(jì)效益。

3 討論

近年來，嗜水氣單胞菌等造成的海水養(yǎng)殖細(xì)菌病逐年增加，大都采用抗生素治療這些細(xì)菌性疾病[11]?？股胤揽亓瞬≡腥?，也導(dǎo)致了耐藥菌株的出現(xiàn)[12]。1957年美國首次觀察到耐磺胺藥物殺鮭氣單胞菌Aeromonas salmonicida，該菌引起了虹鱒的大規(guī)模感染、死亡；1971年在日本大麻哈魚Oncorhynchus keta體內(nèi)檢測到耐磺胺藥物和氯霉素的殺鮭氣單胞菌；20世紀(jì)80年代末，多重耐藥性嗜水氣單胞菌的出現(xiàn)導(dǎo)致淡水魚患嚴(yán)重的細(xì)菌性敗血癥在全國范圍內(nèi)流行，都表明了多種致病菌產(chǎn)生了單一或者多重耐藥性[13]。此外，抗生素在水產(chǎn)品中高殘留，導(dǎo)致接觸人體耐藥菌增加，耐藥性逐漸增強(qiáng)?？傊?，抗生素以及化學(xué)藥物的濫用、誤用等造成了海水養(yǎng)殖環(huán)境的惡化；大量致病性耐藥菌株的出現(xiàn)，使水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)遭受巨大經(jīng)濟(jì)損失；食品中抗生素高殘留，極大威脅了人類的健康。

中草藥具有特殊的抗病原微生物機(jī)制，治療細(xì)菌性疾病效果較好[14]。研究表明，中草藥主要通過調(diào)動(dòng)機(jī)體內(nèi)的積極因素來減弱細(xì)菌對組織的破壞以及降低細(xì)菌毒力等方式來發(fā)揮抑菌作用[14]。如豬苓、黃芪等中草藥可以提高外周血淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率、增加雞淋巴細(xì)胞花環(huán)的形成等。然而，部分中草藥的抗菌機(jī)制主要通過對菌體直接發(fā)揮作用而達(dá)到抑菌和殺菌作用，如大蒜分子中含有的氧原子可與半胱氨酸分子中細(xì)菌生長繁殖所必需的巰基結(jié)合，使巰基變成了非活性物質(zhì)，極大抑制了細(xì)菌的生長繁殖。

相關(guān)文獻(xiàn)顯示，中草藥防治嗜水氣單胞菌性細(xì)菌病比抗生素具有明顯的獨(dú)特優(yōu)勢[15]。中草藥是中國醫(yī)學(xué)瑰寶，是提高防病治病水平、增加經(jīng)濟(jì)效益以及發(fā)展綠色水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和人類健康的需要[5,16]；中草藥具有抗菌、抗病作用，如黃芩、黃柏等能夠抗菌、調(diào)節(jié)機(jī)體自身免疫，增強(qiáng)免疫力等[17,18]；中草藥無藥殘、抗藥性不顯著、來源廣泛、無公害等，應(yīng)用中草藥防治魚病越來越引起科研工作者的關(guān)注[16]。黃岑、訶子具有廣泛的抑菌譜，應(yīng)用廣泛。這兩種中草藥對大腸桿菌Escherichia coli、綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa均有一定的抑菌作用[19]，本試驗(yàn)也顯示嗜水氣單胞菌對這兩種中藥極為敏感，其中訶子對嗜水氣單胞菌的抑菌作用最強(qiáng)，這與陶健等[15]、羅新等[20]的研究結(jié)果一致。訶子內(nèi)含有糖類、多種氧化酶等，具有廣泛的藥理作用。厚樸多用于臨床治療細(xì)菌性疾病、炎癥等，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)、日本漢方醫(yī)學(xué)已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用[20]。嗜水氣氣胞菌對連翹表現(xiàn)耐藥，這與陳曉利等[10]試驗(yàn)結(jié)果不同，其主要原因可能在于菌株分離、來源地、基因以及中草藥煎煮方法等不同。本研究選取“人-畜-魚”共患-嗜水氣單胞菌，進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，旨在篩選出對嗜水氣單胞菌有較強(qiáng)抑制作用的中草藥，為中草藥臨床治療由嗜水氣單胞菌引起的細(xì)菌病提供了重要理論參考。中草藥成分復(fù)雜，有效成分和抗菌機(jī)制、作用機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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參考文獻(xiàn)

［1］ 周宇,周秋白.嗜水氣單胞菌防控技術(shù)研究進(jìn)展［J］.生物災(zāi)害科學(xué),2012,35（2）:126-133,141.

［2］ 方一風(fēng),潘曉藝,藺凌云,等.嗜水氣單胞菌對喹諾酮類藥物耐藥的分子機(jī)制［J］.微生物學(xué)報(bào),2014,54（2）:174-182.

［3］ 盧靜,王振寧,陳銳,等.幾種中藥單體和抗生素對嗜水氣單胞菌及溫和氣單胞菌的體外抑菌活性研究［J］.水生生物學(xué)報(bào),2013,37（6）:1128-1132.

［4］ 姜艷麗,李麗麗.嗜水氣單胞菌的研究進(jìn)展［J］.黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2015（2）:142-146.

［5］ 胡金城,劉金蘭,呂愛軍,等.中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用［J］.天津水產(chǎn),2016（1）:15-22.

［6］ 張靜,張夢華,劉晴晴,等.中藥提取物對耐藥大腸桿菌MIC及acrA基因表達(dá)量的影響［J］.中國獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012,32（5）:728-732.

［7］ 李春濤,陳霞,張其中,等.100種中草藥體外抑殺嗜水氣單胞菌的藥效研究［J］.淡水漁業(yè),2012,42（2）:27-34.

［9］ 李儀奎.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,2006.

［10］ 陳曉利,彭彬,占愛思,等.黃鱔源嗜水氣單胞菌的體外中藥藥敏試驗(yàn)［J］.淡水漁業(yè),2014,44（2）:43-46.

［11］ Andreoni F and Magnani M.Photobacteriosis:prevention and diagnosis［J］.Journal ofImmunologyResearch,2014,5（28）:1-7.

［12］ 陳霞,張其中,李春濤.50種中草藥體外抑殺嗜水氣單胞菌的藥效研究［J］.中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào),2011,33（11）:862-865.

［13］ 孟思妤,孟長明,陳昌福.水產(chǎn)養(yǎng)殖中控制抗生素類藥物的使用（四）［J］.科學(xué)養(yǎng)魚,2015,31（9）:87.

［14］ 丁瑞.中藥抗病原微生物作用的現(xiàn)代研究進(jìn)展［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2013,22（21）:2387-2389.

［15］ 陶健,李紹戊,劉紅柏.21種中草藥及復(fù)方制劑對嗜水氣單胞菌的體外抑菌作用［J］.水生態(tài)學(xué)雜志,2013,34（3）:90-93.

［16］ 郭曉瑞.中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中的應(yīng)用［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2017（11）:232-233.

［17］ 焦世璋.中草藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用［J］.中獸醫(yī)學(xué)雜志,2016（4）:73.

［18］ 侯文久,楊鳳影,王維新.中草藥對刺參腐皮綜合癥病原菌的抑菌試驗(yàn)［J］.中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2013,29（5）:76-80.

［19］ 劉占文.對中草藥防治魚病的思考［J］.農(nóng)民致富之友,2016（13）:167.

［20］ 羅新,張其中.42種中草藥對嗜水氣單胞菌的體外抑菌試驗(yàn)［J］.淡水漁業(yè),2011,41（3）:61-65.