硫酸銅對梭鱸幼魚的急性毒性及其對車輪蟲的滅殺作用

王秋實(shí) ，王樂 ，裴月 ，曹頂臣 ，李崇文 ，鄭先虎 ，吳學(xué)工 ，王炳謙

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070；2.天津天祥水產(chǎn)有限責(zé)任公司，天津 300000）

梭鱸Sander lucioperca屬鱸形目Pericformes鱸科Percidae梭鱸屬Stizostedion，主要分布于歐洲的咸海、黑海、里海和波羅的海水系的河流、湖泊，以及等鹽線在0.7%～0.9%范圍的海區(qū)[1]，在我國分布于新疆的額爾齊斯河、伊犁河[2]和黑龍江水系。梭鱸肉質(zhì)優(yōu)良、無肌間刺，氨基酸含量高[3]，是歐洲重要的養(yǎng)殖魚類，近年我國梭鱸的人工養(yǎng)殖逐步發(fā)展起來[4-6]，是一種適合池塘、湖泊、水庫增殖的優(yōu)良種類。

車輪蟲有280余種，是常見的魚類寄生蟲，在我國發(fā)現(xiàn)5屬近80種，屬寄生性纖毛蟲原生動物[7]。生產(chǎn)中常用硫酸銅防治車輪蟲病。目前已有學(xué)者進(jìn)行了硫酸銅對梭鱸的急性毒性研究[1,2,8]，但用硫酸銅防治梭鱸的車輪蟲病尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過研究不同濃度硫酸銅對梭鱸的急性毒性及對車輪蟲的滅殺作用，旨在探索用硫酸銅有效滅殺車輪蟲的安全用量，為梭鱸車輪蟲病的防治提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)魚平均體質(zhì)量（3.59±0.19）g，平均體長（6.48±0.45）cm，為天津天祥水產(chǎn)有限責(zé)任公司提供的當(dāng)年苗種，親本來自寧夏地理群體。從確診患有車輪蟲病的養(yǎng)殖池中隨機(jī)選取試驗(yàn)魚，鏡檢患病率約30%，試驗(yàn)前停食1d，放入水族箱中暫養(yǎng)。

試驗(yàn)用五水硫酸銅為藍(lán)色粉末或晶體，大連康宇特種化工有限公司生產(chǎn)，含量≥96%。

1.2 方法

1.2.1 病魚流行病學(xué)特征觀察

首先對病魚的體表、鰓和攝食、游動行為等進(jìn)行目測觀察，隨后取病魚體表黏液和鰓絲在顯微鏡下觀察車輪蟲的寄生情況。

1.2.2 急性毒性試驗(yàn)

試驗(yàn)用水為呼蘭試驗(yàn)場地下水，曝氣72h，水溫22.5～24℃，溶解氧 6.4～8.0 mg/L，pH7.8～8.2。試驗(yàn)容器為長方形聚乙烯塑料箱（54cm×36cm×40cm），試驗(yàn)水體50L。先配制成1 000mg/L的五水硫酸銅母液，再按比例稀釋至各試驗(yàn)濃度。

在正式試驗(yàn)前，參考硫酸銅生產(chǎn)使用量和文獻(xiàn)資料，先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定硫酸銅對梭鱸的24 h全致死濃度下限和96 h無致死濃度上限。根據(jù)該濃度范圍，按照等對數(shù)間距設(shè)置五水硫酸銅質(zhì)量濃度為0.40mg/L、0.70mg/L、1.22mg/L、2.14mg/L、3.75mg/L 和6.57mg/L共6個(gè)試驗(yàn)濃度梯度組，設(shè)1個(gè)空白對照組，每個(gè)濃度設(shè)2個(gè)平行，隨機(jī)放入30尾魚，采用靜水生物法[9]，進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)。為保證試驗(yàn)水體中的藥物濃度和水質(zhì)，每24h更換50%的試驗(yàn)液，試驗(yàn)全程不投喂，微充氣。

試驗(yàn)開始后連續(xù)12h觀察魚的中毒癥狀、死亡狀況，試驗(yàn)魚停止呼吸、對外界刺激無反應(yīng)為死亡，及時(shí)清除死魚。統(tǒng)計(jì)各濃度組24h、48h和96h的死亡個(gè)體數(shù)。

1.2.3 硫酸銅對車輪蟲的滅殺作用

按照急性毒性試驗(yàn)的濃度梯度組，設(shè)置1個(gè)對照組和6個(gè)車輪蟲滅殺效果觀察組，每組隨機(jī)放入30尾試驗(yàn)魚，每4h各組分別隨機(jī)撈取3尾魚，用顯微鏡觀察鰓絲和體表黏液中車輪蟲的滅殺情況。如間隔4h連續(xù)2次取樣觀察無車輪蟲或蟲體全部死亡，即認(rèn)定試驗(yàn)魚體上車輪蟲病原滅殺成功。

1.2.4 硫酸銅治療車輪蟲病的生產(chǎn)性試驗(yàn)

選取梭鱸養(yǎng)殖車間中2個(gè)發(fā)病池（面積12m2，水深50cm的水泥池，每池1 700尾）進(jìn)行硫酸銅治療車輪蟲病的生產(chǎn)性試驗(yàn)。參照生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)用量和急性毒性試驗(yàn)的結(jié)果，將硫酸銅用水溶化后全池潑灑至池水濃度為0.7mg/L，靜水充氣消殺24h后，將魚移至消過毒的新養(yǎng)殖池（新池條件同消毒池）。連續(xù)10 d觀察車輪蟲的滅殺效果和魚死亡情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用寇氏法（Karder）[10]計(jì)算硫酸銅對梭鱸的24h、48h和 96h的半致死濃度（LC50），公式為：

lgLC50的標(biāo)準(zhǔn)誤（S）的計(jì)算公式：

95%可信限（X）的計(jì)算公式：

式中：Xi與Xi+1為相鄰兩組的劑量對數(shù)；Pi與Pi+1為相鄰兩組動物死亡百分比；d為相鄰兩組濃度對數(shù)差。

硫酸銅對梭鱸的安全濃度（SC）計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 流行病學(xué)特征觀察

本試驗(yàn)中發(fā)病的梭鱸幼魚攝食減弱，個(gè)別個(gè)體現(xiàn)離群獨(dú)游、反應(yīng)遲緩。顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)，約有30%左右的個(gè)體鰓絲和體表黏液中發(fā)現(xiàn)車輪蟲活體。在100倍視野下，平均5個(gè)視野可見2～3個(gè)車輪蟲。感染車輪蟲的個(gè)體，鰓絲和體表黏液增多，部分個(gè)體鰓絲充血、腫脹，為感染車輪蟲病的初期癥狀。

2.2 硫酸銅對梭鱸的急性毒性

兩組高濃度（3.75mg/L和6.57mg/L）試驗(yàn)魚在試驗(yàn)開始3h后出現(xiàn)呼吸急促、體表黏液增多、反應(yīng)遲鈍的現(xiàn)象；5h后兩組部分個(gè)體頭斜向上懸停于水中，對外界刺激幾乎失去反應(yīng)；7h后6.57mg/L組中部分個(gè)體掙扎跳躍，開始出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，死亡個(gè)體身體僵直，體色發(fā)白，口、鰓蓋張開；9h后3.75mg/L組個(gè)體開始死亡。

低濃度組的試驗(yàn)魚在試驗(yàn)初期活動正常，與對照組相似，對外界刺激時(shí)反應(yīng)迅速。5h后1.22mg/L和2.14mg/L組的試驗(yàn)魚開始出現(xiàn)輕微反應(yīng)遲鈍的中毒癥狀；22 h后兩組個(gè)別魚開始死亡。

對照組和0.40mg/L組、0.70mg/L組的試驗(yàn)魚一直無死亡。各濃度組魚死亡率見表1。

表1 硫酸銅對梭鱸毒性試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Effects of different copper sulfate concentrations on pikeperch Sander lucioperca

硫酸銅對梭鱸的半致死濃度和安全濃度見表2。由表2可知，硫酸銅對梭鱸的LC50隨時(shí)間的延長而逐漸減小，表明硫酸銅對梭鱸的毒性隨時(shí)間延長而逐漸增加。

2.3 硫酸銅對車輪蟲的滅殺作用

表2 硫酸銅對梭鱸的半致死濃度和安全濃度Tab.2 LC50and safe concentrations of copper sulfate in pikeperch Sander lucioperca

試驗(yàn)開始4h時(shí)，0.40mg/L和0.70mg/L兩組魚鰓絲和體表黏液中仍能觀察到活體車輪蟲，但與對照組相比，蟲體活力減弱，數(shù)量平均減少到1個(gè)左右；8h后，僅0.40mg/L組仍能觀察到少量車輪蟲，約10個(gè)視野可見1～2個(gè)活體，多數(shù)蟲體已死亡；20h后，0.40mg/L組車輪蟲滅殺率達(dá)到100%。濃度高于0.70mg/L的4個(gè)濃度組在試驗(yàn)開始4 h后滅殺率即達(dá)100%。

2.4 硫酸銅治療車輪蟲病的生產(chǎn)性試驗(yàn)

兩個(gè)試驗(yàn)池全池潑灑0.7mg/L硫酸銅24h后，10d內(nèi)試驗(yàn)魚僅死亡1尾，患病魚攝食和日常行為恢復(fù)正常，取鰓絲和體表黏液在顯微鏡下觀察，未發(fā)現(xiàn)寄生的車輪蟲，表明0.7mg/L硫酸銅消毒24h，已成功治愈試驗(yàn)魚的車輪蟲病。

3 討論

硫酸銅是漁業(yè)生產(chǎn)中常用的重金屬鹽類藥物，游離的銅離子能夠破壞氧化還原酶系統(tǒng)的活性，阻礙代謝蛋白質(zhì)的合成[11]，可以治療原生動物引起的寄生蟲病[12]，還能殺滅一些低等藻類，控制藻類生長，對部分真菌和細(xì)菌也有一定的效果[13]，尤其是對纖毛蟲類寄生蟲病有明顯的治療效果。本研究中，硫酸銅對梭鱸的48hLC50為2.35mg/L，高于銀鱸Bidyanus bidyanus魚種（0.76 mg/L）[14]，低于加州鱸Micropterus salmoides魚苗（8.00mg/L）[15]、澳洲寶石鱸 Scortum barcoo稚魚（9.10mg/L）[16]，根據(jù)農(nóng)藥對魚類急性毒性等級評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，屬中毒藥物[17]（1.0～10.0），表明梭鱸對硫酸銅的敏感性較弱。硫酸銅的安全濃度為0.59mg/L，接近漁業(yè)生產(chǎn)中的常用量0.4～0.7mg/L。本研究中，在濃度為0.7mg/L時(shí)，梭鱸96h的死亡率為0，因此認(rèn)為可以全池潑灑0.4～0.7mg/L硫酸銅治療梭鱸的寄生蟲病，或可用于調(diào)節(jié)養(yǎng)殖池塘的藻相和菌相。由于硫酸銅會損傷魚類鰓、內(nèi)臟器官，富集在魚體內(nèi)[18]，所以應(yīng)盡量使用較低的潑灑濃度治療車輪蟲病。本研究中硫酸銅對梭鱸幼魚的安全濃度為0.59mg/L，在實(shí)際使用量超過該濃度時(shí)，應(yīng)密切觀察施藥池塘，出現(xiàn)異常情況及時(shí)采取補(bǔ)救措施。

硫酸銅濃度 0.4mg/L 20h、0.7mg/L 8h，高于0.7mg/L時(shí)4h，即可有效滅殺魚體表寄生的車輪蟲，殺蟲率可達(dá)100%。硫酸銅滅殺車輪蟲所需的時(shí)間隨其濃度增加而縮短。急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，硫酸銅濃度為1～2mg/L時(shí)，試驗(yàn)魚初期活動正常，與對照組相似，5h后出現(xiàn)中毒癥狀，所以在養(yǎng)殖生產(chǎn)中也可以采用高濃度、短時(shí)間的藥浴方式治療車輪蟲病。參考其他魚類使用硫酸銅藥浴的經(jīng)驗(yàn)用量，可以使用1.5mg/L硫酸銅浸泡2h，間隔1d以同劑量再用一次的藥浴方式。

藥物的毒性效應(yīng)與試驗(yàn)魚的生長階段、生理狀態(tài)和所處水體水質(zhì)理化指標(biāo)等因素密切相關(guān)[19]。本研究中，硫酸銅對梭鱸的24hLC50和48hLC50均低于陳羅明等[1]、韓小麗等[2]的研究結(jié)果，其原因可能是本試驗(yàn)使用的試驗(yàn)魚為患病魚，水溫高于前兩者。本試驗(yàn)中，患病魚已有行為異常（攝食減弱）和魚體損傷（鰓絲腫脹充血、體表黏液增多），抗逆性必然減弱，導(dǎo)致對硫酸銅的敏感度增強(qiáng)。同時(shí)有研究表明，硫酸銅對魚類的毒性隨著溫度的升高而上升[20,21]。本試驗(yàn)水溫高于前兩者研究中的水溫，勢必會造成硫酸銅毒性的增加，導(dǎo)致24hLC50和48hLC50降低。車輪蟲病為魚類養(yǎng)殖常見的寄生蟲病，一年四季均可發(fā)生，發(fā)病高峰水溫20～28℃，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中，應(yīng)根據(jù)水溫、水質(zhì)和養(yǎng)殖生物的生理狀態(tài)，適當(dāng)選擇硫酸銅的使用時(shí)間和使用量。

綜上所述，梭鱸幼魚對硫酸銅的敏感性較弱，可以使用硫酸銅防治車輪蟲病。流水養(yǎng)殖中，在靜水充氣的條件下，0.4mg/L消殺20h，或0.7mg/L消殺8h，即可達(dá)到治療的效果，也可以采用1.5mg/L硫酸銅浸泡2h，間隔1d以同劑量再用一次的藥浴方式；池塘養(yǎng)殖中，若具備增氧設(shè)施，可全池潑灑0.4～0.7mg/L濃度進(jìn)行治療，如未達(dá)到理想效果，可在7d后再施藥一次。但在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)患病魚的發(fā)育階段、魚體狀態(tài)和水質(zhì)條件，先進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，確定適宜的潑灑濃度，同時(shí)準(zhǔn)備好補(bǔ)救措施，以達(dá)到安全生產(chǎn)和有效治療的目的。

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