內(nèi)蒙古奇乾地區(qū)媒介蜱攜帶伯氏疏螺旋體的調(diào)查研究

湯 芳，周 磊，蔣蘭芬， 欒 進(jìn)，浮飛翔

萊姆病（Lyme disease, LD）是由伯氏疏螺旋體（Borrelia burgdorferii, B.b）侵犯機(jī)體而引起的全身性多系統(tǒng)疾病，該病是經(jīng)媒介蜱傳播的一種自然疫源性疾病。LD分布相當(dāng)廣泛，我國自1986年首次在黑龍江省海林縣林區(qū)發(fā)現(xiàn)該病以來，大小興安嶺、天山、長白山、燕山、阿爾泰山等林區(qū)均存在人群感染[1]。內(nèi)蒙古奇乾地區(qū)地處中俄界河額爾古納河畔，大興安嶺北部原始森林腹地，北緯 52°11′45.30″ ，東經(jīng)120°46′21.42″，為高寒山林和寒溫帶大陸性氣候，年平均氣溫-6 ℃，年平均降雨量436.5 mm。該地區(qū)自然資源豐富，媒介物種多樣，生態(tài)環(huán)境適宜LD的發(fā)生流行。為進(jìn)一步了解奇乾地區(qū)媒介蜱中B.b感染及基因分型情況，本研究對該地區(qū)進(jìn)行了選點(diǎn)調(diào)查研究。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集 在媒介蜱活動(dòng)高峰期（4—6月），根據(jù)奇乾地區(qū)自然地理和生態(tài)環(huán)境的特點(diǎn)，選擇有代表性的生境（山地森林景觀和灌叢草地景觀）作為調(diào)查點(diǎn)，用布旗法采集游離蜱，媒介蜱經(jīng)分類鑒定后使其保持存活狀態(tài)，待送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原學(xué)的檢測。

1.2 實(shí)驗(yàn)室檢測

1.2.1 標(biāo)本處理及模板制備 將采集到的媒介蜱標(biāo)本放入用75%乙醇浸泡10 min，高壓滅菌濾紙吸干媒介蜱體表乙醇，0.9%氯化鈉溶液漂洗3次后，將單只媒介蜱置于1.5 ml離心管中，加入DNA提取緩沖液50 μl，用組織研磨器將蜱搗碎、研磨，沸水中煮10 min，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增 根據(jù)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)特異性引物[2-3]，用PE9700 PCR擴(kuò)增儀（美國ABI公司）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系由 10×PCR buffer 2.5 μl，dNTP MIX 2 μl，Taq 酶 0.3 μl，上下引物各 l μl組成，充分混勻后加入DNA模板1 μl；擴(kuò)增條件 94 ℃ 5 min→94 ℃ 30 s ，41 ℃ 30 s，72 ℃1 min→72 ℃10 min，擴(kuò)增36個(gè)循環(huán)。取PCR產(chǎn)物5 μl，用1.2% 的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成像分析系統(tǒng)（法國Vilber Lourmat公司）觀察結(jié)果。每次實(shí)驗(yàn)都設(shè)立空白（水）對照，并采取嚴(yán)格措施以避免污染。

1.3 DNA同源性比較和聚類分析 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京天一輝遠(yuǎn)生物公司測序，通過Internet進(jìn)入美國國家生物技術(shù)信息中心（www.ncbi.nlm.nih.gov）站點(diǎn)后，把測序所獲得序列與GenBank中已注冊的基因序列進(jìn)行BLAST比對。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)錄入、分析采用SPSS 13.0軟件，計(jì)算相應(yīng)頻數(shù)和陽性率。

2 結(jié) 果

2.1 媒介蜱采集情況 共采集游離蜱320只，其中全溝硬蜱293只（91.56%），嗜群血蜱5只（1.56%），森林革蜱22只（6.88%）。

2.2 媒介蜱感染情況 奇乾地區(qū)媒介蜱B.b感染陽性攜帶86只，陽性率為26.88%。其中全溝硬蜱B.b陽性攜帶率為29.01%（85/293）；森林革蜱B.b陽性攜帶率4.55%（1/22）；嗜群血蜱未檢測出B.b（詳見表1）。媒介蜱攜帶B.b有3種基因型：B.garinii、B.afzelii和B.miyamotoi，其中B.garinii陽性攜帶率為18.13%（58/320），B.afzelii陽性攜帶率為6.25%（20/320），B.miyamotoi陽性攜帶率為2.50%（8/320）。

表1 奇乾地區(qū)媒介蜱B.b感染情況[例（%）]Table 1 Prevalence of B.b in ticks among Qiqian region[cases(%)]

2.3 序列分析 將PCR陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序、序列比對和聚類分析發(fā)現(xiàn)，B.b陽性序列為B.garinii、B.afzelii和B.miyamotoi基因型。

3 討 論

本研究共采集媒介蜱320只，其中全溝硬蜱293只（91.56%），嗜群血蜱5只（1.56%），森林革蜱22只（6.88%），表明內(nèi)蒙古奇乾地區(qū)媒介蜱以全溝硬蜱為優(yōu)勢蜱種。媒介蜱B.b陽性攜帶率為26.88%，其中全溝硬蜱B.b陽性攜帶率為29.01%，森林革蜱B.b陽性攜帶率4.55%，嗜群血蜱均未檢測出B.b，提示全溝硬蜱是該地區(qū)LD的主要傳播媒介。媒介蜱攜帶B.b有3種基因型：B.garinii、B.afzelii和B.miyamotoii，結(jié)果提示該地區(qū)B.b基因型存在多樣性的特點(diǎn)。其中B.garinii陽性攜帶率最高，為18.13%（58/320），B.afzelii、B.miyamotoi陽性攜帶率分別為6.25%（20/320）和2.50%（8/320）。B.garinii是B.b最常見的基因型別，許多國家、地區(qū)的宿主動(dòng)物和媒介蜱體內(nèi)都可以檢測到該基因型的存在[4-12]。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古大興安嶺林區(qū)媒介蜱及鼠體內(nèi)存在B.b的感染，以全溝硬蜱的感染率最高，以B.garinii為主要基因型[13]。B.afzelii是B.b第二種常見的基因型別，分布范圍和B.garinii類似，在嚙齒動(dòng)物和媒介蜱中也有類似的分布[14]。B.miyamotoi屬于疏螺旋體屬中的回歸熱螺旋體，但生物學(xué)上與B.b中的B.garinii、B.afzelii和B.burgdorferi等更為接近。主要寄生在硬蜱體內(nèi)，常與B.garinii、B.afzelii等基因型混合感染，目前尚未發(fā)現(xiàn)有B.miyamotoi單獨(dú)感染的報(bào)道[15-16]。

內(nèi)蒙古地區(qū)是我國蜱媒傳染病的重要疫區(qū)之一，在宿主動(dòng)物和媒介蜱中發(fā)現(xiàn)攜帶有包括B.b、斑點(diǎn)熱群立克次體、嗜吞噬細(xì)胞無形體、查菲埃立克體、森林腦炎病毒等多種病原體感染。奇乾地區(qū)自然景觀復(fù)雜多樣、生態(tài)物種豐富，為LD自然疫源地的形成和持續(xù)存在提供了必要條件。因此，下一步研究我們還須要從傳播媒介、宿主動(dòng)物和易感人群3個(gè)流行環(huán)節(jié)開展自然疫源地流行病學(xué)調(diào)查，確定自然疫源地性質(zhì)與特征，掌握疫源地演變規(guī)律，獲得系統(tǒng)的流行病學(xué)本底資料。

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