DNA微陣列芯片法檢測耐藥結(jié)核分枝桿菌的價值探討

何 建

2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告顯示我國肺結(jié)核患者的耐藥情況較嚴(yán)重。與2000年調(diào)查結(jié)果相比，異煙肼（isoniazid, INH）的耐藥率增加了11.0個百分點(diǎn)，利福平（rifampin,RFP）的耐藥率減少了7.7個百分點(diǎn)，對結(jié)核分枝桿菌分離菌株的總耐多藥率為6.8%，雖然下降了3.9個百分點(diǎn)，但仍高于全球的平均水平[1]。如此高的耐藥率突顯耐多藥防控的必要性、緊迫性。耐藥結(jié)核病的控制包括患者發(fā)現(xiàn)、治療、管理等各過程。其中耐藥結(jié)核病患者的發(fā)現(xiàn)是控制耐藥結(jié)核病的第一環(huán)節(jié)。既往檢測耐多藥的經(jīng)典藥物敏感試驗(yàn)為比例法或絕對濃度法，但檢測時間過長。WHO現(xiàn)推薦采用快速耐藥結(jié)核病診斷技術(shù)以利于該類患者的早期發(fā)現(xiàn)。宜昌市第三人民醫(yī)院自2014年5月起采用DNA微陣列芯片法進(jìn)行結(jié)核病的INH、RFP耐藥快速檢測，并與傳統(tǒng)藥物敏感試驗(yàn)作比較，以了解該方法對耐藥結(jié)核菌檢測的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集本院2014年5月1日—2015年5月31日結(jié)核分枝桿菌痰涂片陽性或痰結(jié)核培養(yǎng)陽性標(biāo)本。其中痰涂片陽性標(biāo)本125份，痰培養(yǎng)陽性標(biāo)本40份。

1.2 痰菌檢查 采用萋爾-尼爾遜（ziehl-neelsen,Z-N）抗酸染色法進(jìn)行痰涂片檢查。

1.3 痰結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)及藥物敏感試驗(yàn) 結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)采用改良羅氏培養(yǎng)基，采用對硝基苯甲酸生長實(shí)驗(yàn)進(jìn)行初步菌種鑒定，對鑒定為結(jié)核分枝桿菌的菌株采用絕對濃度法進(jìn)行分枝桿菌藥物敏感試驗(yàn)。試驗(yàn)方法依據(jù)中國防癆協(xié)會2006版《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[2]進(jìn)行。

1.4 DNA微陣列芯片法檢測 DNA微陣列芯片法采用北京博奧生物有限公司藥物敏感檢測試劑盒進(jìn)行檢測，操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.4.1 核酸提取 向核酸提取管中加入80 μl核酸提取液，加入用無菌接種環(huán)挑取的培養(yǎng)陽性的1個菌落或涂片陽性的痰液，使用Extractor 36核酸快速提取儀震蕩5 min，90 ℃水浴5 min，5000 rpm離心1 min，所提取核酸于-20 ℃暫存。

1.4.2 PCR擴(kuò)增 每個樣品設(shè)3個復(fù)孔進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。分別取PCR擴(kuò)增試劑1、2、3 各18 μl均加入 200 μl離心管中（3管），將核酸提取管中的上清液（包含待檢樣品DNA）2 μl依次加入到3個管中，并置于PCR擴(kuò)增儀中，按說明書中的熱循環(huán)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中PCR擴(kuò)增試劑1、2、3擴(kuò)增的分別是分枝桿菌屬探針序列（擴(kuò)增產(chǎn)物1），rpoB基因突變位點(diǎn)序列（擴(kuò)增產(chǎn)物2），katG和inhA基因突變位點(diǎn)序列（擴(kuò)增產(chǎn)物3）。PCR引物序列由中國博奧生物有限公司提供[3]。

1.4.3 芯片雜交 將雜交緩沖液加熱至50 ℃使其完全融化，混勻后各取9 μl分別裝于2管中，將PCR產(chǎn)物1、PCR產(chǎn)物2各取3 μl加入上述裝有雜交緩沖液的管中配制雜交混合物R；將PCR產(chǎn)物1、PCR產(chǎn)物3各取3 μl配制雜交混合物H；將雜交反應(yīng)混合物加熱至95 ℃變性5 min，冰浴3 min。吸取13.5 μl雜交混合物加入加樣孔，微陣列1或3加入雜交混合物R，微陣列2加入雜交混合物H，蓋上雜交盒并密封放入50 ℃恒溫水浴鍋中，時間為120 min。

1.4.4 芯片洗滌及干燥 將雜交盒拆開，將芯片取出放入盛有芯片洗滌液Ⅰ的容器中，并在恒溫?fù)u床上振蕩，速度為80～100 rpm，洗滌3 min。再用芯片洗滌液Ⅱ在恒溫?fù)u床上振蕩，速度為80～100 rpm，洗滌3 min。然后將芯片置于離心機(jī)中進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為800 rpm，時間為5 min，甩干后掃描。

1.4.5 芯片掃描和結(jié)果判讀 使用微陣列芯片掃描儀（Luxscan 10K-B）和相應(yīng)軟件進(jìn)行信號讀取及結(jié)果判讀。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用CHISS 2004軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在本研究中，金標(biāo)準(zhǔn)為傳統(tǒng)藥物敏感試驗(yàn)，以檢測菌株表型耐藥為真陽性，以檢測菌株表型敏感為真陰性。分析DNA微陣列芯片法檢測的靈敏度、特異度及一致性。2種方法檢出率的差異性檢驗(yàn)用配對四格表χ2檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DNA微陣列芯片法檢測INH耐藥性 2種方法檢測INH耐藥結(jié)果見表1，配對χ2=0.500，P=0.480，表明2種方法檢出率具有一致性，一致率為98.8%。以傳統(tǒng)藥物敏感試驗(yàn)絕對濃度法為金標(biāo)準(zhǔn)，DNA微陣列芯片法檢測INH的靈敏度為87.5%，特異度為100%。

表1 2種方法檢測INH耐藥結(jié)果（例）Table 1 Results of INH resistance by 2 methods(cases)

2.2 DNA微陣列芯片法檢測RFP耐藥性 2種方法檢測RFP耐藥結(jié)果見表2，配對χ2=0.000，P=1.000，表明2種方法檢出率具有一致性，一致率為99.4%。以傳統(tǒng)藥物敏感試驗(yàn)絕對濃度法為金標(biāo)準(zhǔn)，DNA微陣列芯片法檢測RFP的靈敏度為83.3%，特異度為100%。

表2 2種方法檢測RFP耐藥結(jié)果（例）Table 2 Results of RFP resistance by 2 methods(cases)

2.3 DNA微陣列芯片法檢測耐多藥性 2種方法檢測耐多藥結(jié)果見表3，配對χ2=0.000，P=1.000，表明2種方法檢出率具有一致性，一致率為100%。以傳統(tǒng)藥物敏感試驗(yàn)絕對濃度法為金標(biāo)準(zhǔn)，DNA微陣列芯片法檢測耐多藥的靈敏度為100%，特異度為100%。

表3 2種方法檢測耐多藥耐藥結(jié)果（例）Table 3 Results of multi drug resistance by 2 methods(cases)

3 討 論

傳統(tǒng)的藥物敏感性方法是以固體培養(yǎng)為基礎(chǔ)的絕對濃度法或比例法，但需較長時間。一般從患者就診到獲得藥物敏感結(jié)果需要2～3個月[4]。采用液體培養(yǎng)法，如MGIT960系統(tǒng)，可將藥物敏感試驗(yàn)時間縮短至2～4周，但仍不能滿足臨床需要[5]。因此，快速、簡便的耐藥檢測方法一直是結(jié)核病研究的重要內(nèi)容之一，也是及時治療以保證結(jié)核病治療效果的重要前提。

目前熱門的快速檢測方法主要是分子生物學(xué)檢測方法?，F(xiàn)只有該種方法能在2 d得到耐藥檢測結(jié)果。WHO也推薦采用分子生物學(xué)技術(shù)中的線性探針和Xpert MDR/RIF技術(shù)用于耐藥結(jié)核病的檢測[6]。DNA微陣列芯片技術(shù)與線性探針相似，都是通過檢測2種抗結(jié)核一線藥物INH和RFP的3個耐藥基因katG、inhA和rpoB啟動子的野生型及不同突變型來判斷是否耐藥[7]。主要技術(shù)特點(diǎn)是根據(jù)這3個耐藥基因的特異性保守核酸序列，設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物及相應(yīng)的寡核苷酸探針，固定在芯片表面上，經(jīng)與針對性的擴(kuò)增被檢測樣本的 DNA片段雜交，并通過芯片掃描儀掃描雜交后的芯片上特定位置的熒光信號，從而檢測出樣品的耐藥基因信息。該檢測方法可在6 h內(nèi)得到結(jié)果[8]。

本研究表明，DNA微陣列芯片法診斷INH耐藥的敏感度為87.5%，診斷RFP耐藥的敏感度為83.3%，診斷耐多藥的敏感度為100%，三者特異度均為100%。DNA微陣列芯片法與傳統(tǒng)藥物敏感試驗(yàn)診斷INH耐藥、RFP耐藥、耐多藥的一致率為98.8%～100%。顯示了DNA微陣列芯片檢測技術(shù)具有較高的敏感度和特異度，與傳統(tǒng)藥物敏感方法相比，一致性較高。因此，具有較好的可靠性及較高的檢測效能。

本研究的不足之處是敏感的樣本較少，使檢驗(yàn)效能偏低，影響檢驗(yàn)結(jié)果的可信度。后續(xù)有待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行檢測并比較分析以得出更為準(zhǔn)確的結(jié)論。

在本研究中，2例INH單耐藥和1例RFP單耐藥未被DNA微陣列芯片法檢出，原因可能有以下兩方面。首先，商品化DNA微陣列芯片試劑盒受檢測探針的限制，所檢測的耐藥基因及相應(yīng)位點(diǎn)不能覆蓋目前已知的所有耐藥基因及相應(yīng)位點(diǎn)。例如：①結(jié)核分枝桿菌對INH的耐藥與katG、inhA、kasA、ndh、ahpC 5種基因突變或缺失有關(guān)，其中80%以上的耐INH分離株與katG和inhA基因發(fā)生突變有關(guān)[9-10]。而目前采用的結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測試劑盒主要通過檢測INH耐藥相關(guān)基因katG 315、inhA及位點(diǎn)來判斷是否耐藥。因此，如果是另外3種基因位點(diǎn)突變引起的耐藥，可能該試劑盒無法檢出。②結(jié)核分枝桿菌對 RFP的耐藥主要與RNA聚合酶亞單位rpoB基因的突變有關(guān)，是否與RNA 聚合酶亞單位其他3 個基因rpoA、rpoC 或rpoZ 突變相關(guān)目前尚不清楚。廖小琴等[11]分析發(fā)現(xiàn)57株耐RFP結(jié)核分枝桿菌中有50株為rpoB基因突變，2株為rpoC突變。并且在rpoB 765、1001、1156位及rpoC 51位發(fā)現(xiàn)新的突變位點(diǎn)。而所使用的結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測試劑盒探針檢測范圍僅為RFP耐藥相關(guān)基因rpoB的531、526、513、516、511、533位共6個位點(diǎn)。因此，若為探針檢測范圍之外的其他相關(guān)基因（如rpoC或rpoB）的位點(diǎn)突變，則該檢測試劑盒可能無法檢出。

其次，在實(shí)際檢測過程中，如果待檢標(biāo)本痰菌量太少或含有雜質(zhì)，會造成核酸提取、擴(kuò)增失敗。因此，研發(fā)新的能覆蓋所有已知耐INH、RFP相關(guān)基因及位點(diǎn)檢測的試劑盒可能是進(jìn)一步提高DNA微陣列芯片法耐藥檢測技術(shù)陽性率的方法之一。

總之，本研究對DNA微陣列芯片法檢測耐藥結(jié)核菌的效果作了初步評價，發(fā)現(xiàn)該檢測方法具有較高的敏感度和特異度，與傳統(tǒng)藥物敏感試驗(yàn)相比具有較好的一致率。而且該方法可靠性較好且檢測所需時間短，可以作為臨床結(jié)核病耐藥性的快速篩查方法。

[1]全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室. 2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告［J］. 中國防癆雜志，2012，34(8):485-508.

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