苦杏仁中苦杏仁苷的閃式提取工藝研究

禹琦

（湖南婁底市中心醫(yī)院，湖南 婁底 417000）

苦杏仁為薔薇科植物山杏Prunus armeniaca L.var.ansu Maxim.、西伯利亞杏 Prunus sibirica L.、東北杏 Prunus mandshurica（Maxim.）Koehne或杏Prunus armeniaca L.的夏季采收的干燥種子。具有降氣止咳平喘、潤腸通便之功能。常用于咳嗽氣喘、胸滿痰多、腸燥便秘［1］。其主要有效成分是苦杏仁苷，也稱維生素 B17，具有止咳［2］、平喘［3］之功能，此外，其對心血管［4］、消化系統(tǒng)［5-6］、免疫系統(tǒng)［7-8］、泌尿系統(tǒng)等［9］也具有藥理作用。

目前關(guān)于苦杏仁苷的提取報道較多，主要是煎煮、回流、超聲等傳統(tǒng)方法，都存在提取時間較長、溶劑消耗大、能耗大等問題?？嘈尤受帐且环N氰苷類物質(zhì)，分為D型和L型，前者有藥理活性后者卻沒有。而D型苦杏仁苷在高溫下會轉(zhuǎn)變成L型從而失去藥理活性［10］。所以常規(guī)提取方式有可能會引起D型苦杏仁苷的異構(gòu)化，而導(dǎo)致失活。閃式提取技術(shù)是一種新型提取方法，它是利用閃式提取器將浸泡在溶劑里的物質(zhì)快速破碎，并通過超強振動與高速攪拌讓有效成分迅速釋放出來的一種提取方法［11］。閃式提取時間短至幾分鐘甚至幾秒鐘，溶劑用量小，能耗低，且無須加熱，有利于對熱不穩(wěn)定物質(zhì)的提取［12-13］。目前還未見到有關(guān)苦杏仁苷閃式提取法的報道。筆者通過實驗研究閃式提取法提取苦杏仁苷，希望為苦杏仁苷的提取提供一種新的思路和方法。

1 儀器與試藥

JHBE—50S閃式提取器（河南金鼐科技發(fā)展有限公司）；Agilent1100液相色譜儀；BT224S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；XL-60C型中藥粉碎機（湖南旭眾機械設(shè)備有限公司）。

苦杏仁苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110820-201607）；苦杏仁（長沙佰佳中藥飲片有限責(zé)任公司）；乙腈為色譜純；水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦杏仁苷的含量測定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Kromasil C18柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（8∶92）；檢測波長：207 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：25℃；進樣量：10μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 將苦杏仁苷對照品干燥至恒重，精密稱量10.3 mg，放入容量瓶中，加入甲醇溶液定容至100 mL，搖勻，制成質(zhì)量濃度為103μg·mL-1的苦杏仁苷對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 將苦杏仁粉碎，過二號篩，精密稱量粉末約0.3 g，按相應(yīng)實驗條件制備出提取液，過濾，濾液回收乙醇，濃縮至浸膏，減壓干燥，得提取物。精密稱量提取物20 mg，放入容量瓶中，精密加入甲醇100 mL，搖勻使其完全溶解，過濾，取續(xù)濾液即得供試品溶液。

2.1.4 HPLC法專屬性 取對照品溶液和供試品溶液分別進樣測定，供試品和對照品色譜圖在相應(yīng)時間有對應(yīng)色譜峰，且供試品色譜圖中苦杏仁苷色譜峰與其他組分分離良好，結(jié)果見圖1。

圖1 對照品和供試品的HPLC圖

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取干燥至恒重的苦杏仁苷對照品15.1 mg，放入容量瓶中，加入甲醇溶液定容至50 mL，搖勻。精密量取上述溶液1、2、4、6、8、10 mL，分別移入甲醇至10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。按2.1.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，以苦杏仁苷濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算得回歸方程：Y＝9.144 8X+3.521 1，r＝0.999。表明苦杏仁苷在30.2～302μg·mL-1有良好的線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗 取苦杏仁苷對照品溶液，按2.1.1項下色譜條件重復(fù)測定6次，記錄峰面積，算出苦杏仁苷含量，并計算得RSD值為1.05%。表明儀器精密度良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 配制供試品溶液，分別在室溫下放置0、2、4、6、8、10、12 h，按2.1.1項下色譜條件測定6次，記錄峰面積，算出苦杏仁苷含量，并計算得RSD值為1.31%。表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 重復(fù)性試驗 取同一批苦杏仁，精密稱取6份，分別按2.1.3項下制備成供試品溶液，并按2.1.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，算出苦杏仁苷含量，并計算得RSD值為1.53%。說明其重復(fù)性良好。

2.1.9 回收率試驗 采用加樣回收法，精密移取已知含量的苦杏仁6份，每份約0.15 g，加入對照品溶液適量，揮干溶液。按2.1.3項下制備并按2.1.1項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，算出苦杏仁苷含量，結(jié)果苦杏仁苷的平均回收率為98.56%，RSD為1.71%。說明回收率良好。見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）

2.2 閃式提取工藝的考查

2.2.1 脫脂和提取次數(shù)考查 由于苦杏仁內(nèi)含有大量油脂，有文獻［14-15］報道，提取前需進行脫脂，所以筆者先對脫脂工藝進行考查，同時考查提取次數(shù)。精密稱量苦杏仁粉末6份，每份約0.3 g，其中3份樣品（記為A1、A2、A3）不用石油醚脫脂，另外3份用石油醚（記為B1、B2、B3）脫脂，其余提取條件都相同：提取電壓為100 V，溶劑為70%乙醇，料液比（g∶mL）為1∶10，提取時間為1 min。按2.1.3項下制備并按2.1.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，算出苦杏仁苷含量。結(jié)果見表2。

表2 脫脂和提取次數(shù)對苦杏仁苷提取的影響（n＝3）%

由結(jié)果可知，脫脂和不脫脂對苦杏仁苷的提取含量沒有影響；且第一次提取已將苦杏仁苷基本提取完全。所以確定提取時無須脫脂，提取次數(shù)為一次。

2.2.2 電壓強度的選擇 精密稱量苦杏仁粉末4份，每份約0.3 g，選取60、80、100、120 V 4種強度電壓進行考查。其余提取條件都相同：溶劑為70%乙醇，料液比（g∶mL）為1∶10，提取時間為1 min，提取次數(shù)1次。按2.1.3項下制備并按2.1.1項下色譜條件測定，記錄峰面積，算出苦杏仁苷含量。結(jié)果見圖2。

圖2 電壓強度對苦杏仁苷提取的影響（n＝3）

由結(jié)果可知，提取電壓為100 V時提取含量最高，故選擇電壓為100 V。

2.2.3 正交試驗 參考有關(guān)文獻［16-17］，并通過單因素試驗，采用L9（34）正交設(shè)計，選擇乙醇濃度、料液比（g∶mL）和提取時間3個因素進行正交試驗，優(yōu)選最佳工藝。因素水平表見表3，試驗結(jié)果和方差分析分別見表4～5。

表3 因素水平考察表

表 4 L9（34）正交試驗結(jié)果

表5 正交試驗方差分析

由表5可知，因素A（乙醇濃度）和因素C（提取時間）對提取結(jié)果有顯著性影響，而因素B（料液比）則無顯著性影響。三個因素影響的順序是A（乙醇濃度）＞C（提取時間）＞B（料液比）。綜合結(jié)果，優(yōu)選出最佳閃式提取工藝為A2B1C1，即70%乙醇，料液比1∶6，提取時間1 min。

2.3 驗證試驗

在正交試驗中沒有A2B1C1最佳工藝組合，為驗證此工藝的可靠性，精密稱取苦杏仁3份，按優(yōu)選出的最佳工藝組合進行提取，計算苦杏仁苷含量。結(jié)果分別為3.82%、3.88%、3.85%，證明此工藝合理，重復(fù)性好。

2.4 提取方法比較

采用乙醇回流法［18］和水提法［19］做為對照，采用文獻中所提供的方法提取苦杏仁苷，并計算含量和轉(zhuǎn)移率，與閃式提取法結(jié)果對比，結(jié)果見表6。

表6 各提取方法的比較（n＝3）

由結(jié)果可知，相比另外兩種方法，閃式提取法無論從提取次數(shù)、提取時間、料液比還是苦杏仁苷的含量和轉(zhuǎn)移率都較好。

3 討論

近年來對苦杏仁苷的提取研究較多，但還未見閃式提取方法的報道。本實驗通過單因素考查和正交試驗確定了閃式提取法的最佳工藝，即不須脫脂，提取次數(shù)為一次，電壓為100 V，溶劑為70%乙醇，料液比為1∶6，提取時間為1 min。該工藝簡單、節(jié)能，苦杏仁苷的含量和轉(zhuǎn)移率都較好，有利于苦杏仁藥物的綜合利用與開發(fā)。

筆者在正交試驗之前，對乙醇濃度、料液比和提取時間3個因素分別進行了單因素考查，得到的最優(yōu)水平分別為70%、1∶8和1.5 min，然后再選取此水平以及高低兩個水平進行正交試驗。

傳統(tǒng)提取方法為水提、醇提、超聲等提取方式，水提、醇提等提取時間一般需3 h，超聲提取時間也需30min以上，而閃式提取法僅僅只需1min，大大縮短了提取時間，該方法工藝簡單、高效節(jié)能。并且閃式提取法是將物質(zhì)快速破碎，通過超強振動與高速攪拌讓有效成分迅速釋放出來的一種提取方法，無需加熱，不會破壞有效成分。所以閃式提取法是一種具有發(fā)展前景的新技術(shù)。

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