不同濃縮方法對丹參提取液的影響△

劉鐵軍，孫勝斌，陳翔宇，王文鵬，周永妍，姜國志

（1.河北省中藥注射液工程技術研究中心，河北 石家莊 051430；2.神威藥業(yè)集團有限公司，河北 石家莊 051430；3.中藥注射劑新藥技術開發(fā)國家地方聯(lián)合工程實驗室，河北 石家莊 051430）

丹參注射液是由丹參經(jīng)水提、醇沉、酸沉、堿沉制成的無菌水溶液，因此其主要有效成分為水溶性酚酸類化合物［1-5］。據(jù)文獻報道，丹參水溶性有效成分均具有酚酸性結構，如丹酚酸A（Salvianolic acid A，Sal A）、丹酚酸 B（Salvianolic acid B，Sal B）、丹酚酸C（Salvianolic acid C，Sal C）、迷迭香酸（Rosmarinic Acid），均是由不同分子的丹參素與咖啡酸縮合而成，而丹參素是丹酚酸類化合物的基本化學結構，其化學名為 β-3，4-二羥基苯乳酸（3，4-hydroxybenyl lactic acid）。其他還包括丹酚酸 D、E、F、G等［6-12］。酚酸類成分在藥理實驗中已被證明是丹參活血、祛瘀、止痛的物質基礎，具有抗血小板聚集、抗血酸形成，促進纖維蛋白降解，防治動脈粥樣硬化及抗心肌缺血的作用［13］。由于酚酸類成分的縮合特性，部分化合物熱穩(wěn)定性不好，因此，丹參提取精制過程中濃縮方法的選擇會不同程度地影響丹參水溶性酚酸類成分。本文采用不同的濃縮方法考察對丹參提取液有效成分的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

CPA225D電子天平（德國賽多利斯）；Agilent 1260型液相色譜儀。

1.2 試藥

丹參素鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110855-201614，含量98.1%）；原兒茶醛對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110810-201007，含量98.2%）；咖啡酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110885-200101）；迷迭香酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111871-201505，含量98.8%）；丹酚酸B對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號111562-201615，含量96.2%）；乙腈為色譜級；水為重蒸餾水。

樣品為神威藥業(yè)集團有限公司提供。

2 方法

2.1 不同濃縮條件樣品的制備

2.1.1 常壓濃縮 取丹參提取液于95～100℃下常壓蒸發(fā)濃縮，分別于濃縮至原體積的1／2、1／5、1／10、1／20時，即相當于原體積濃縮了2倍、5倍、10倍、20倍時取樣。

2.1.2 減壓濃縮 取丹參提取液于55～65℃，真空度0.08～0.09 MPa下減壓濃縮，分別于濃縮至5、10、15、20倍體積時取樣。

2.1.3 納濾膜濃縮 取丹參提取液于過濾壓力1.5～2.0 MPa下過濾濃縮，分別于濃縮至5、10、15、20倍體積時取樣。

2.2 丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.03%的三氟乙酸水；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：286 nm，梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 對照品溶液的制備 分別取丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B對照品適量，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加0.2%冰醋酸的10%甲醇溶液制成含0.2 mg·mL-1丹參素鈉、0.1 mg·mL-1咖啡酸、0.05 mg·mL-1原兒茶醛、0.5 mg·mL-1迷迭香酸、0.5 mg·mL-1丹酚酸 B的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取適量提取濃縮液，加0.2%冰醋酸的10%甲醇溶液稀釋，既得。見圖1～2。

圖1 對照品色譜圖

2.3 總酚酸測定

2.3.1 對照品溶液的制備 取丹參素鈉對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含0.1 mg的溶液，即得。

2.3.2 標準曲線的制備 精密量取對照品溶液2、3、4、5、6、7 mL，分別置10 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，照紫外-可見分光光度法，在280 nm的波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密量取提取濃縮液，加水稀釋，搖勻，依法測定吸光度，既得。

圖3 對照品溶液200～400 nm全波長掃描圖

圖4 供試品溶液200～400 nm全波長掃描圖

3 結果與分析

3.1 含量測定方法學考察

3.1.1 標準曲線及線性范圍 取上述混合對照品溶液，按2.2方法，分別進樣1、2、5、10、20、30μL，以對照品進樣量為橫坐標，樣品峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程分別為：Y丹參素鈉＝57.128X+5.868，r＝0.999 8，Y原兒茶醛＝138.17 X+31.556，r＝0.999 6，Y咖啡酸＝13.136 X+5.427 1，r＝0.999 5，Y迷迭香酸＝87.656 X+2.496 8，r＝0.999 7，Y丹酚酸B＝50.245 X+4.791 2，r＝0.999 8，說明丹參素鈉進樣量在0.20～6.0μg、咖啡酸進樣量在0.1～3.0μg，原兒茶醛、迷迭香酸進樣量在0.050～1.50μg、丹酚酸B進樣量在0.5～15.0μg線性關系良好。

3.1.2 精密度試驗 取對照品溶液連續(xù)進樣6次，丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B的峰面積 RSD分別為0.65%、1.82%、1.21%、081%、1.35%，表明精密度良好。

3.1.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（批號：16052811），分別于0、2、4、8、12、24、48 h時進樣檢測，丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B峰面積RSD分別為1.95%、0.74%、1.12%、1.25%、0.83%，說明被測溶液在48 h內穩(wěn)定。

3.1.4 重復性試驗 按供試品溶液制備方法，取同一批樣品（批號：160528A1），共6份，依法測定。丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B含量 RSD分別為 1.73%、1.28%、0.86%、1.21%、1.98%，說明本測定方法重復性良好。

3.1.5 加樣回收試驗 精密量取2 mL提取液稀釋至10 mL，取1.0 mL，平行6份，分別加入0.4 mg·mL-1丹參素鈉、0.05 mg·mL-1原兒茶醛、0.1 mg·mL-1咖啡酸、0.05 mg·mL-1迷迭香酸、1.0 mg·mL-1丹酚酸B的混合對照品溶液0.8、0.8、1.0、1.0、1.2、1.2 mL，混勻后進樣檢測。以峰面積計算回收率，丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸和丹酚酸B的加樣回收率分別為 98.62%、99.21%、99.76%、98.96%和 100.06%，RSD分別為1.13%、1.21%、0.86%、1.63和1.52%，均符合要求。

3.2 不同的濃縮方法對丹參提取液有效成分的影響

3.2.1 丹參提取液不同濃縮方法各含量結果 見表2。

3.2.2 不同方法濃縮過程各含量的變化 隨濃縮時間的延長，常壓濃縮、減壓濃縮過程丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、總酚酸含量逐步增加，增幅逐漸減小，常壓濃縮含量增幅較減壓濃縮大；丹酚酸B含量逐步減小，降幅逐漸減小，常壓濃縮含量降幅較減壓濃縮大；迷迭香酸較穩(wěn)定，3種濃縮方法對該含量均無顯著影響。膜濃縮過程對各含量均無顯著影響。見圖5～10。

表2 丹參提取液不同濃縮方法各成分含量

圖5 濃縮過程丹參素鈉含量的變化

圖6 濃縮過程原兒茶醛含量的變化

圖7 濃縮過程咖啡酸含量的變化

圖8 濃縮過程迷迭香酸含量的變化

圖9 濃縮過程丹酚酸B含量的變化

圖10 濃縮過程總酚酯含量的變化

3.2.3 丹酚酸B降解規(guī)律分析 基于以上數(shù)據(jù)，進一步分析了解丹酚酸B的降解規(guī)律。由于丹酚酸B的降解是由于酯鍵的裂解產(chǎn)生，一般酯鍵的水解符合一級反應的特點，因此，以樣品丹酚酸B濃度的自然對數(shù)值為縱坐標，受熱時間為橫坐標進行線性回歸分析。丹酚酸B常壓濃縮降解回歸方程為Ln（C）＝-0.114 t+2.947 6，減壓濃縮降解回歸方程為Ln（C）＝-0.083 t+2.947 6。說明提取后丹參提取液在pH值一定的條件受熱濃縮，其過程完全符合一級動力學方程，隨溫度由55～65℃變?yōu)?5～100℃，其反應速率常數(shù)由-0.081 3變?yōu)?0.114。見圖11。

圖11 濃縮過程丹酚酸B降解趨勢

4 結論與討論

為減少實驗誤差，過程中嚴格控制了加熱溫度、濃縮時間、真空度等參數(shù)，盡可能保證整個濃縮過程的速度，為后續(xù)物質降解規(guī)律的初步探索做準備。

在受熱條件下，丹參提取液中酚酸類成分發(fā)生了降解與轉化，出現(xiàn)了丹酚酸B顯著降低，丹參素鈉、原兒茶醛、咖啡酸、總酚酸含量顯著增加的現(xiàn)象，這是由于丹酚酸B是由3分子的丹參素和1分子的咖啡酸縮合形成的，具有兩個羧基，在受熱和不同pH環(huán)境條件可發(fā)生降解，降解可產(chǎn)生丹參素、咖啡酸，在酸性條件下受熱甚至進一步降解為迷迭香酸，這與文獻報道一致［14-15］。而實驗中迷迭香酸未見明顯變化，可能是由于在該藥液pH值環(huán)境下較穩(wěn)定未發(fā)生降解。

丹參提取液濃縮過程中丹酚酸B的降解主要是由于酯鍵的裂解產(chǎn)生的，其降解規(guī)律符合一級反應的特點。

丹參提取液中存在熱不穩(wěn)定性成分，采用不同的濃縮方法會對其酚酸類成分產(chǎn)生明顯影響，因此，生產(chǎn)過程中應嚴格控制溫度、真空度、時間等參數(shù)，以保證批間的一致穩(wěn)定。通過實驗可以看出，納濾膜濃縮的優(yōu)點在于防止了熱敏性成分的降解，最大程度地保持與藥液物質基礎一致，因此，應采用納濾膜濃縮方法對丹參提取液進行濃縮。

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