廣西現(xiàn)行生產(chǎn)應(yīng)用的家蠶一代雜交種親本品種對(duì)家蠶微粒子病抗性的研究

李 標(biāo) 黃旭華 湯慶坤 蔣滿貴 黃深惠 唐 亮 羅梅蘭 夏 青 黃揚(yáng)玉 王 霞 潘志新

(1廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)研究院， 廣西南寧 530007； 2廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站， 廣西南寧 530007)

家蠶微粒子病是一種由家蠶微孢子蟲(chóng)(Nosemabombycis，N.b)感染、寄生引起的重要蠶病，由于其具有食下傳染和胚種傳染2種傳染方式，對(duì)養(yǎng)蠶業(yè)的危害很大，也曾經(jīng)給歐洲養(yǎng)蠶國(guó)家(法國(guó)、意大利等)的蠶業(yè)帶來(lái)過(guò)毀滅性打擊[1]；尤其對(duì)蠶種生產(chǎn)危害巨大，即使現(xiàn)在中國(guó)各蠶區(qū)采取了“母蛾檢疫，淘汰有毒蠶種”的方式控制家蠶微粒子病胚種傳染，但家蠶微粒子病危害還是時(shí)有發(fā)生。據(jù)我們調(diào)查，廣西壯族自治區(qū)近10年平均每年就有4.56萬(wàn)張一代雜交種因發(fā)生微粒子病被淘汰。目前，蠶種生產(chǎn)中除了嚴(yán)格執(zhí)行蠶種檢疫措施來(lái)控制家蠶微粒子病的胚種傳染外，主要依賴徹底消毒和嚴(yán)格的飼養(yǎng)操作技術(shù)來(lái)預(yù)防家蠶微粒子病的食下傳染，盡管消耗了大量的人力、物力，但有時(shí)對(duì)家蠶微粒子病的防控效果仍然不佳[2]。蠶業(yè)生產(chǎn)中家蠶微粒子病的發(fā)生原因比較復(fù)雜，魯興萌等[3]分析認(rèn)為家蠶微粒子病的發(fā)生和流行受蠶種生產(chǎn)量、蠶品種、生產(chǎn)季節(jié)、生產(chǎn)場(chǎng)所和生產(chǎn)形式等因素的影響。眾多學(xué)者的研究也證明不同家蠶品種之間對(duì)家蠶微粒子病的抗性有強(qiáng)弱之分[4-6]。據(jù)我們調(diào)查，不同季節(jié)(春季、秋季)蠶種生產(chǎn)微粒子病發(fā)生率存在明顯差異，如1992—2016年間廣西家蠶原種上半年微粒子病檢出率是下半年的2.3倍；在蠶種生產(chǎn)中同一雜交組合不同品系親本微粒子病檢出率也有明顯差異，如2017年上半年廣西家蠶原種生產(chǎn)中出現(xiàn)日系親本微粒子病檢出率明顯比中系親本高，影響下一級(jí)蠶種(一代雜交種)生產(chǎn)平衡的情況。為了充分了解家蠶微粒子病發(fā)生的原因，本文通過(guò)研究廣西蠶區(qū)現(xiàn)行生產(chǎn)應(yīng)用的一代雜交種的親本品種對(duì)家蠶微粒子病的抗性差異，并分析原種生產(chǎn)中不同親本品種的微粒子病檢出率差異，以期探明不同家蠶品種微粒子病的危害程度，為蠶種生產(chǎn)防控家蠶微粒子病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試蠶品種 兩廣二號(hào)的4個(gè)親本品種932、芙蓉、7532、湘暉，桂蠶2號(hào)的2個(gè)親本品種8810、8711，桂蠶N2的4個(gè)親本品種NC9C、NC99R、NJ7、NJZ，均由廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站(以下簡(jiǎn)稱廣西蠶業(yè)總站)原種場(chǎng)保存提供。

1.1.2 供試病原 家蠶微孢子蟲(chóng)(Nosemabombycis，N.b)，為廣西蠶業(yè)總站蠶病研究室保存提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原的配制 將提純的N.b按10倍稀釋法配制成孢子濃度為107、106、105、104、103個(gè)/mL等5個(gè)濃度梯度的孢子液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原的接種方法 采用食下接種的方法測(cè)定各個(gè)供試家蠶品種對(duì)N.b的感染抵抗力，分別取200 μL配制好的各級(jí)N.b的孢子液，均勻涂抹于面積約為8.0 cm2的1片桑葉上，稍微晾干后飼喂2齡起蠶，以涂抹等量滅菌水的桑葉作為空白對(duì)照區(qū)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)區(qū)，每區(qū)30頭。待蠶吃完帶毒桑葉后更換蠶座，然后撒石灰消毒蠶體蠶座并換飼正常桑葉，在室溫條件下正常飼養(yǎng)。12 d(5齡第2天)后對(duì)每頭蠶進(jìn)行鏡檢，調(diào)查感染微粒子病的家蠶頭數(shù)[7]。

1.2.3 不同家蠶品種的親本品種對(duì)家蠶微粒子病的抗性調(diào)查 根據(jù)各處理的N.b感染百分率，用Reed-Muench法[1]算出各家蠶品種的親本品種對(duì)N.b的半數(shù)感染濃度(IC50)和半數(shù)感染劑量(ID50)，以中間數(shù)值親本品種作為參比品種(ID50指數(shù)為1.00)，計(jì)算其余親本品種的ID50指數(shù)。以此作為各親本品種對(duì)家蠶微粒子病的抗性水平，并進(jìn)行方差分析，比較不同家蠶品種的親本品種之間對(duì)N.b的抵抗力差異[8]；并對(duì)中系親本和日系親本不同系統(tǒng)間的微粒子病抗性進(jìn)行方差分析。

1.2.4 兩廣二號(hào)的不同親本品種和不同時(shí)間微粒子病檢出率差異調(diào)查 以廣西現(xiàn)行生產(chǎn)應(yīng)用量最大的兩廣二號(hào)的4個(gè)親本品種(932、芙蓉、7532和湘暉)為調(diào)查對(duì)象，研究分析2004—2017年各親本品種的微粒子病檢出率發(fā)生情況，并將微粒子病檢出率以反正弦值Sin-1(P)1/2的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)換[3]后進(jìn)行方差分析，比較原種生產(chǎn)中各親本品種間的微粒子病檢出率差異。同時(shí)調(diào)查廣西家蠶原種生產(chǎn)中2004—2017年養(yǎng)蠶期間每個(gè)月(4月、5月、6月、8月、9月和10月)的微粒子病檢出率，并以反正弦值Sin-1(P)1/2的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)換后進(jìn)行方差分析，研究分析不同時(shí)期微粒子病檢出率的差異，分析查找原種微粒子病檢出率差異產(chǎn)生的原因。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同家蠶品種的親本品種間對(duì)家蠶微粒子病的抗性差異

從表1可以看出，不同家蠶品種的親本品種對(duì)N.b的IC50最大的親本品種為NJ7，其孢子的IC50達(dá)到4.43×104個(gè)/mL，最低的親本品種為NC9C，其孢子的IC50為2.26×104個(gè)/mL，說(shuō)明廣西現(xiàn)行生產(chǎn)應(yīng)用的家蠶品種的親本品種對(duì)N.b抵抗力較弱；以芙蓉作為參比品種(ID50指數(shù)為1.00)，ID50指數(shù)最高的親本品種為NJ7(1.37)，最低的親本品種為NC9C(0.83)，差距僅為1.65倍。經(jīng)抗性差異顯著性測(cè)定，NJ7等10個(gè)親本品種間的ID50指數(shù)差異均不顯著。

表1NJ7等10個(gè)親本品種對(duì)家蠶微孢子蟲(chóng)(Nosemabombycis，N.b)的抗性差異顯著性檢驗(yàn)結(jié)果

蠶品種半數(shù)感染濃度(IC50)/(個(gè)/mL)半數(shù)感染劑量(ID50)/(個(gè)/頭蠶)實(shí)數(shù)指數(shù)NJ7443×10429500137aNC99R384×10425567119a湘暉359×10423933111a8711328×10421867102a芙蓉323×10421500100a8810318×10421167098aNJZ312×10420800097a7532312×10420800097a932309×10420567096aNC9C226×10417867083a

表中數(shù)據(jù)后相同的小寫英文字母a表示差異不顯著(P>0.05)。

2.2 不同家蠶系統(tǒng)親本間對(duì)微粒子病的抗性差異比較

采用方差分析(t檢驗(yàn))的方法比較中系親本(932、芙蓉、8810、NC9C和NC99R)和日系親本(7532、湘暉、8711、NJ7和NJZ)間的家蠶微粒子病抗性(ID50指數(shù))差異，從表2可以看出，t=1.014

表2廣西現(xiàn)行生產(chǎn)應(yīng)用的中系親本和日系親本對(duì)家蠶微粒子病的抗性差異顯著性(t檢驗(yàn))

系統(tǒng)樣本數(shù)平均值標(biāo)準(zhǔn)差t值t005顯著性中系50992012910142306P>005日系510880167

2.3 兩廣二號(hào)的不同親本品種和不同生產(chǎn)時(shí)間微粒子病檢出率的差異比較

對(duì)廣西現(xiàn)行生產(chǎn)應(yīng)用量最大的兩廣二號(hào)的4個(gè)親本品種(932、芙蓉、7532和湘暉)于2004—2017年的微粒子病檢出率調(diào)查結(jié)果(表3)表明，兩廣二號(hào)的4個(gè)親本品種的微粒子病檢出率從小到大的順序依次是932<芙蓉<湘暉<7532。從表4可以看出，兩廣二號(hào)的4個(gè)親本品種的微粒子病檢出率存在一定的差異，其中親本品種932與7532、932與湘暉、芙蓉與7532的微粒子病檢出率差異達(dá)到極顯著水平，芙蓉與湘暉、湘暉與7532的微粒子病檢出率差異達(dá)到顯著水平，而932與芙蓉的微粒子病檢出率差異不顯著。我們?cè)趯?duì)廣西家蠶微粒子病發(fā)生情況的調(diào)查中還發(fā)現(xiàn)，不同月份生產(chǎn)的家蠶原種的微粒子病檢出率存在差異(表5)。從表4-5和圖1可以看出，微粒子病檢出率峰值發(fā)生在每年4—6月份生產(chǎn)的原種，對(duì)每年不同月份生產(chǎn)的家蠶原種的微粒子病檢出率數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析結(jié)果(表6)表明，4月份與8月份、4月份與9月份、4月份與10月份、5月份與8月份的微粒子病檢出率差異均達(dá)到極顯著水平；5月份與9月份、6月份與8月份、6月份與9月份、6月份與10月份的微粒子病檢出率差異均達(dá)到顯著水平，但5月份與10月份的微粒子病檢出率差異不顯著。因此，不同時(shí)期生產(chǎn)的蠶種其微粒子病檢出率有差異，蠶種生產(chǎn)中發(fā)生家蠶微粒子病應(yīng)該是綜合因素作用的結(jié)果。

表32004—2017年兩廣二號(hào)4個(gè)親本品種的微粒子病檢出率

年份不同親本品種的微粒子病檢出率/%932芙蓉湘暉753220042142982503092005115081162250200615212822916220071401622502752008181292236229200929828739348020102142362692752011275303363380201219917222225020131721902753342014214372319372201544842554151620162072432693292017263214538585平均220243308339

表4兩廣二號(hào)4個(gè)親本品種的微粒子病檢出率差異檢驗(yàn)結(jié)果

品種微粒子病檢出率/%7532339aA湘暉308bAB芙蓉243cBC932220cC

表中數(shù)據(jù)后不相同的小寫英文字母表示差異顯著(P<0.05)，不相同的大寫英文字母表示差異極顯著(P<0.01)；表6相同。

表5廣西2014—2017年不同月份生產(chǎn)的家蠶原種的微粒子病檢出率

年份不同月份生產(chǎn)的家蠶原種的微粒子病檢出率/%4月份5月份6月份8月份9月份10月份20043803853032431991282005190081140081081181200617215237205705708120073192984090810991812008380236152214190099200934930956519922928720101813142501812292362011250440409292263222201226320719911525619020133091900992361281992014497275281281140281201574928726919945938520164172563761401992562017469483523000000099平均352279310165180201

圖1 2004—2017年廣西不同月份生產(chǎn)的家蠶原種的微粒子病發(fā)生趨勢(shì)圖

表6不同月份生產(chǎn)的家蠶原種微粒子病檢出率

月份微粒子病檢出率/%4352aA5279abAB6310aABC8165cC9180cBC10201bcBC

3 小結(jié)與討論

經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定驗(yàn)證廣西現(xiàn)行生產(chǎn)應(yīng)用的一代雜交種的10個(gè)親本品種對(duì)家蠶微粒子病抵抗力較弱，均屬于敏感品種，抵抗力最強(qiáng)的親本品種NJ7對(duì)N.b孢子的IC50只有4.43×104個(gè)/mL，僅是抵抗力最弱的親本品種NC9C的1.65倍，統(tǒng)計(jì)分析顯示這些親本品種間對(duì)N.b的抗性差異不顯著。同時(shí)，對(duì)中系親本(932、芙蓉、8810、NC9C和NC99R)和日系親本(7532、湘暉、8711、NJ7和NJZ)間的抗性差異分析結(jié)果顯示，2個(gè)系統(tǒng)對(duì)家蠶微粒子病的抗性差異不顯著，這與邢東旭等[6]的研究結(jié)果類似。

對(duì)廣西生產(chǎn)應(yīng)用量最大的兩廣二號(hào)的4個(gè)親本品種(932、芙蓉、7532、湘暉)2004—2017年的微粒子病檢出率進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，兩廣二號(hào)4個(gè)親本品種的微粒子病檢出率存在一定差異，其中932與7532、932與湘暉、芙蓉與7532的微粒子病檢出率差異達(dá)到極顯著水平，芙蓉與湘暉、湘暉與7532的微粒子病檢出率差異達(dá)到顯著水平，而932與芙蓉的微粒子病檢出率差異不顯著。調(diào)查還發(fā)現(xiàn)蠶種生產(chǎn)中各親本品種的微粒子病發(fā)生情況與實(shí)驗(yàn)室測(cè)定各親本品種對(duì)N.b抗性結(jié)果不一致，說(shuō)明家蠶品種抗性差異不是蠶種生產(chǎn)發(fā)生家蠶微粒子病的唯一主要因素，蠶種生產(chǎn)發(fā)生家蠶微粒子病是由家蠶品種和其他因素綜合作用引起的。

通過(guò)對(duì)廣西家蠶原種生產(chǎn)實(shí)績(jī)的調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，不同月份生產(chǎn)的蠶種微粒子病檢出率存在差異，微粒子病檢出率峰值發(fā)生在4月份和6月份生產(chǎn)的原種，其中4月份與8月份、4月份與9月份、4月份與10月份、5月份與8月份的微粒子病檢出率差異均達(dá)到極顯著水平；5月份與9月份、6月份與8月份、6月份與9月份、6月份與10月份的微粒子病檢出率差異達(dá)到顯著水平，但5月份與10月份的微粒子病檢出率差異不顯著。說(shuō)明在蠶種生產(chǎn)中氣候環(huán)境條件差異對(duì)微粒子病的發(fā)生有重要影響。蠶業(yè)生產(chǎn)中家蠶微粒子病的致病因素在整個(gè)養(yǎng)蠶環(huán)境和養(yǎng)蠶過(guò)程中都是廣泛存在的，在大多數(shù)情況下，家蠶微粒子病的發(fā)生是多種致病因素共同作用的結(jié)果，與家蠶品種、病原分布和外界環(huán)境密切相關(guān)[1]。潘志新等[9]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，廣西蠶種生產(chǎn)微粒子病的發(fā)生率與同期養(yǎng)蠶環(huán)境微孢子蟲(chóng)的分布情況具有極顯著的相關(guān)性，養(yǎng)蠶環(huán)境中微孢子蟲(chóng)污染造成家蠶食下傳染應(yīng)該是蠶種生產(chǎn)微粒子病發(fā)生的重要原因；在亞熱帶蠶區(qū)，每年上半年氣候高溫多濕適宜桑樹(shù)和家蠶生長(zhǎng)的同時(shí)也適合野外昆蟲(chóng)生長(zhǎng)，增大野外昆蟲(chóng)微孢子蟲(chóng)交叉感染家蠶的風(fēng)險(xiǎn)[10-11]，另外，不同家蠶品種對(duì)環(huán)境條件的適應(yīng)性存在差異，不適宜的條件會(huì)影響家蠶的生理狀態(tài)，進(jìn)而影響家蠶對(duì)微粒子病的抗性。因此，蠶業(yè)生產(chǎn)中對(duì)家蠶微粒子病的防治要根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際情況和各種致病因素的相互關(guān)系，正確分析和判斷對(duì)家蠶微粒子病發(fā)生起主要和決定性作用的致病因素，從而采取有針對(duì)性的有效措施，控制其發(fā)生和流行。

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