蛇人工繁殖試驗及其仔魚異速生長模式的研究

張海龍，樊啟學，張云龍，吳巧婉，汪 帆，邵韋涵，胡偉華

(華中農(nóng)業(yè)大學水產(chǎn)學院，武漢 430070)

蛇(SaurogobiodabryiBleeker)，俗稱船釘子、白楊魚，屬鯉形目(Cypriniformes)亞科(Gobioninae)蛇屬(Saurogobio)。每年3-4月，蛇在卵石和沙質底質的淺水河灘產(chǎn)卵，卵具微粘性[1-2]?，F(xiàn)在，蛇的自然資源量已大幅下降，蛇的市場價格已達到60元/kg以上，人工繁養(yǎng)勢在必行。而有關蛇人工繁殖的內(nèi)容僅有零星的記錄[3-5]。

魚類在早期生長階段存在異速生長(Allometric growth)現(xiàn)象，其中靜態(tài)異速生長(Static allometry)是最常用的異速生長類型[6-7]。西伯利亞鱘(Acipenserbaeri)[8]、施氏鱘(Acipenserschrencki)[9]、鱸鯉(Percocyprispingi)[10]、大麻哈魚(Oncorhynchusketa)[11]、斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)和鞍帶石斑魚(E.lanceolatus)的雜交子代(青龍斑)[12]等魚類的研究均已證實。

本文對蛇的人工繁殖試驗進行了總結并以仔魚多個形態(tài)學性狀為基礎，對仔魚的異速發(fā)育進行了較為系統(tǒng)的研究，以期為蛇的繁殖生產(chǎn)及種質資源保護提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 蛇親本及產(chǎn)前性腺發(fā)育狀況的觀察

于湖北省黃岡市蘄春縣赤東湖采用地籠捕撈的方式捕獲蛇親本，年齡1+～3+，體重40～95 g，暫養(yǎng)在靜水池塘內(nèi)。水深1.5～2 m ,淤泥厚度0.1～0.2 m。放養(yǎng)前用漂白粉帶水消毒，通過豆粕、豆?jié){和施肥培育浮游動物的方式提供餌料，并混養(yǎng)一定數(shù)量的鰱鳙。

隨機抽取2～4條雌性親本，首先用電子秤測量其體重，然后解剖樣本測量性腺重，肉眼觀察性腺的外觀并用透明液(95 %酒精85份，40 %甲醛10份，冰醋酸5份)透明卵粒后于顯微鏡下鏡檢(成熟卵：卵核發(fā)生偏移，卵粒內(nèi)充滿卵黃，呈青灰色，卵巢呈長囊狀)。計算出成熟卵率(成熟卵粒數(shù)/懷卵數(shù)×100%)、性腺成熟系數(shù)(性腺重/體重×100%)、絕對懷卵量(樣品卵粒數(shù)/樣品重×性腺重)和相對懷卵量(絕對懷卵量/空殼重)。

1.2 蛇人工繁殖及仔魚培育

實驗期間水溫維持在19～26 ℃，挑選出體質健壯、性腺發(fā)育成熟較好、體質量40 g以上的親本進行人工催產(chǎn)。催產(chǎn)劑包括魚類腦垂體(PG)、絨毛膜促性腺激素(HCG)、促黃體素釋放激素類似物(LRH-A2)和馬來酸地歐酮(DOM)。設置4種劑量催產(chǎn)藥物組合進行人工催產(chǎn)試驗：A組合，PG (3 mg/kg)+ LRH-A2(4 μg/kg)；B組合，PG (5 mg/kg)+ LRH-A2(5 μg/kg)；C組合，PG (5 mg/kg)+ LRH-A2(7 μg/kg)+ DOM (3 mg/kg)；D組合，HCG (500 IU/kg)+ LRH-A2(5 μg/kg)+ DOM (1 mg/kg)。催產(chǎn)藥物采用胸鰭基部注射，雄性親本劑量減半。注射催產(chǎn)劑前先置于100 mg/L的MS-222水溶液中麻醉，人工催產(chǎn)、人工授精及孵化方法參照張云龍等[13-14]，研磨的精液用精子保存液(葡萄糖2.9 g，KCl 0.05 g，CaCl20.02 g，NaHCO30.21 g，蒸餾水 100 mL)保存?zhèn)溆肹7]。用體積法估算出產(chǎn)卵量及出苗數(shù)，記錄并統(tǒng)計催產(chǎn)率(產(chǎn)卵的雌魚數(shù)/催產(chǎn)的雌魚數(shù)×100%)、受精率(受精卵數(shù)/樣本卵數(shù)×100%)及孵化率(孵出魚苗數(shù)/受精卵數(shù)×100%)。

開口餌料為蛋黃、浮游動物(輪蟲、無節(jié)幼體為主)。待魚苗有了平游能力，將其轉至池塘內(nèi)通過豆?jié){、豆粕培育。

1.3 仔魚的異速生長

1.3.1 測量性狀及方法

測量性狀包括全長(TL，x1)，吻長(SL，x2)，眼徑(ED，x3)，頭長(HL，x4)，軀干長(TRL，x5)，尾長(TAL，x6)，胸鰭長(PFL，x7)共7個形態(tài)學性狀，破膜當天為0日齡(DAH)，測量至20日齡。

每天上午8點取樣，隨機取20尾，MS-222麻醉后，用帶有刻度目鏡的CX31RTSF顯微鏡以及數(shù)顯卡尺(0～200 mm)測量形態(tài)學指標，精確到0.01 mm，方法參照楊秀平等[15]。

1.3.2 數(shù)據(jù)處理分析

對異速生長方程y=axb(以仔魚全長為自變量x；因變量y為魚體各部分的長度；a為y軸截距，b為異速生長指數(shù))進行l(wèi)og轉換，轉換后為logy=loga+blogx[16]。b=1時為等速生長，仔魚器官的生長與全長等比例生長；b>1時為正異速生長，仔魚器官的生長比全長生長快；b<1時為負異速生長，仔魚器官的生長比全長生長慢。

以Excel 2007統(tǒng)計整理經(jīng)log轉化后的蛇(0～20日齡)各項生長數(shù)據(jù)，進行線性回歸參數(shù)擬合，以決定系數(shù)R2最大值作為曲線擬合標準。用SPSS 18.0軟件進行t檢驗，檢驗b值與1之間以及各階段b值之間的顯著性差異，顯著性水平為α=0.05，t值最大時定為拐點。用Origin 9.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 親魚性腺發(fā)育狀況

2016年雌性親本的體重范圍為42.6～85.3 g，平均體重60 g，性腺重7.5～20.8 g；好卵率73.6%～81.4%，性腺成熟系數(shù)17.6%～24.4%；絕對懷卵量范圍16 265～41 963粒，平均23 395粒，相對懷卵量523～748粒/g，平均581粒/g(見表1)。2015年雌性親本的卵巢中有大量的死卵，顯微鏡下觀察為灰白色，呈混沌狀，無法看清胞內(nèi)狀況。透明液透明后發(fā)現(xiàn)死卵的細胞核已潰散，與胞質混為一體；正常的卵透明后可觀察到明顯的細胞核。相對懷卵量范圍為180～200粒/g，加上鏡檢觀察到有較多的卵細胞處于Ⅰ期，推測這批親本的性腺已經(jīng)退化。

2.2 人工繁殖及仔魚發(fā)育

實驗結果表明注射催產(chǎn)激素HCG (500 IU/kg)+ LRH-A2(5 μg/kg)+ DOM (1 mg/kg)的混合制劑能有效地促使蛇親本產(chǎn)卵。在(22±1)℃時的效應時間為13～18 h。卵直徑為1.09～1.20 mm，吸水膨脹后彈性增強，卵徑為1.52～1.73 mm。產(chǎn)卵量為38.96，孵出魚苗13.5萬尾。平均催產(chǎn)率、平均受精率和平均孵化率分別為75.00%、64.85%和55.15%(見表2)。

表1 蛇雌魚性腺觀察(n=4)Tab.1 Observation of gonads in S.dabryi (n=4)

表2 蛇人工催產(chǎn)、人工授精及孵化效果Tab.2 The results of artificial propagation and hatching of S.dabryi

蛇仔魚(1日齡)全長為(3.86±0.30)mm，全身透明，卵黃囊呈“白熾燈泡”狀，油球明顯。消化管細長，肛門位于卵黃囊末端，吻部及肛門均未開口。4日齡仔魚全長為(5.53±0.29)mm，卵黃囊明顯縮小，消化道膨大變粗，有明顯排遺。5日齡仔魚全長為(5.63±0.22)mm，卵黃囊完全消失。20日齡時仔魚的全長達到(12.67±1.53) mm。

2.3 蛇仔魚的異速生長

2.3.1 全長與日齡的關系

全長隨日齡的變化曲線符合指數(shù)方程，關系式為y=3.70e0.060x(R2=0.888)，擬合曲線見圖1。全長的生長分為兩個階段：10日齡前生長較緩慢(0.19 mm/d)，從10日齡開始進入快速增長期(1.05 mm/d)，即10日齡為全長生長的轉折點。兩個階段的全長生長率之間存在顯著性差異(P<0.05)。隨著日齡的增加，仔魚個體之間發(fā)育的差距逐漸增大。

圖1 蛇早期發(fā)育階段全長與日齡關系Fig.1 The relationship between total length and DAH of S.dabryi during the early life stage

2.3.2 身體各部的異速生長

頭部異速生長模式如圖2所示，頭長的生長在2日齡時出現(xiàn)了拐點，對應的全長為4.90 mm。拐點之前異速生長指數(shù)為b=3.69，與1差異顯著(P<0.05)，表現(xiàn)為正異速生長；拐點后生長率雖有所降低，但仍表現(xiàn)為正異速生長(b=1.18)。軀干部(圖3)表現(xiàn)為負異速生長(b=0.816)，沒有出現(xiàn)生長拐點。如圖4所示，尾長在14日齡時出現(xiàn)生長拐點，對應的全長為8.40 mm，拐點前、后的異速生長指數(shù)分別為b1=4.19，b2=11.13，表現(xiàn)為正異速生長，拐點后尾長的生長速率明顯增加。

圖2 蛇早期發(fā)育階段頭長的異速生長模式Fig.2 Allometric growth of head length in S.dabryi during the early life stage

圖5為游泳器官的異速生長模式，游泳相關器官主要是指各鰭。蛇仔魚胸鰭的異速生長指數(shù)b為0.74，表現(xiàn)為負異速生長，無生長拐點。

圖3 蛇早期發(fā)育階段軀干長的異速生長模式Fig.3 Allometric growth of trunk length in S.dabryi during the early life stage

圖4 蛇早期發(fā)育階段尾長異速生長模式Fig.4 Allometric growth of tail length in S.dabryi during the early life stage

圖5 蛇早期發(fā)育階段胸鰭長的異速生長模式Fig.5 Allometric growth of pectoral fin length in S.dabryi during the early life stage

頭部器官的異速生長模式(圖6)顯示，眼徑在4日齡時出現(xiàn)生長拐點，對應的全長為5.88 mm，拐點前眼徑的生長指數(shù)b為1.01，與1差異不顯著(P>0.05)，表現(xiàn)為等速生長。拐點后生長指數(shù)b為0.95，相對于全長表現(xiàn)為負異速生長。吻長(圖7)表現(xiàn)為正異速生長(b=1.38)，無生長拐點。

圖6 蛇早期發(fā)育階段眼徑的異速生長模式Fig.6 Allometric growth of eyes diameter in S.dabryi during the early life stage

圖7 蛇早期發(fā)育階段吻長的異速生長模式Fig.7 Allometric growth of snout length in S.dabryi during the early life stage

3 討論

3.1 催產(chǎn)劑的篩選及授精過程的處理

2014年通過注射不同劑量組合的PG和LRH-A2進行人工催產(chǎn)，催產(chǎn)率極低；2015年注射的催產(chǎn)藥物在此基礎上添加了DOM，催產(chǎn)率仍然較低，出苗量小于一萬。2016年人工繁殖試驗中將PG替換成HCG，催產(chǎn)率較高，出苗量達到13.5萬尾。研究結果表明，添加HCG能夠促進蛇雌性親本順利排卵。分析原因可能為蛇親本對PG的敏感性不及其它催產(chǎn)激素，與鄧龍君等[17]對雅礱江鱸鯉的人工繁殖、胚胎及卵黃囊仔魚發(fā)育的研究結果類似。2014年試驗過程中發(fā)現(xiàn)蛇的抗應激能力差，直接打針催產(chǎn)后的死亡率極高，第一批親本催產(chǎn)后置于網(wǎng)箱內(nèi)，2 h后雄性親本全部死亡。本研究在人工催產(chǎn)環(huán)節(jié)先對親本進行麻醉處理(MS-222)并對光照、噪音等環(huán)境因子進行控制(于繁殖大棚內(nèi)進行打針)，降低了親本死亡率，提高了受精卵質量。類似的方式于其它魚類研究中也有報道，如刀鱭等[18]。丁淑荃等[5]對蛇精子結構的研究表明蛇精子的結構符合體外受精魚類對精子結構的要求，具有硬骨魚類精子結構的普遍特點。此次人工繁殖試驗的成功說明蛇完全可以通過人工繁殖補充其種群資源量。

判斷進行人工催產(chǎn)的依據(jù)為親本的性腺發(fā)育狀況及卵的成熟度[19]。根據(jù)何學福等[3]對蛇產(chǎn)卵習性的研究，野生蛇于每年3-4月產(chǎn)卵，產(chǎn)卵下限溫度為12 ℃。本實驗觀察發(fā)現(xiàn)蛇在4月份水溫達到18℃時性腺開始成熟，可催產(chǎn)，到5月份時性腺已經(jīng)退化。性成熟的蛇父本腹部細瘦，達到效應時間后，精液不易擠出。而何學福等[3]從人工采精的效果看，雄魚的精液易于流出，集群產(chǎn)卵時能保證種群的延續(xù)。實驗期間雖可通過研磨精巢的方式補充精液，但易造成浪費，另外由于母本個體成熟差異，人工授精這一環(huán)節(jié)可能會重復若干次，故使用精子保存液保存?zhèn)溆煤苡斜匾?/p>

3.2 孵化過程中水霉病的防治

影響魚類人工孵化效率的因素有很多,如水溫、光照強度、DO、水霉病等。何學福等[3]研究結果表明水溫15.6 ℃，受精后81～82 h，胚胎開始破膜。實驗期間孵化水溫維持在21～23 ℃，孵化時間為37～44 h。與柴學軍等[21]研究得出的孵化時數(shù)與水溫呈冪函數(shù)相關，孵化時間隨溫度升高而縮短相一致。后期孵化過程中孵化桶內(nèi)受精卵的水霉現(xiàn)象嚴重，原因分析：(1)蛇的卵微粘性，用黃泥水脫粘時部分卵未脫粘完全。錐形孵化桶的水流由底部垂直向上，桶壁部分為死角，該部分的水得不到有效的循環(huán)，一部分卵粘在桶壁。(2)何學福等[3]將蛇卵的類型歸為沉性和漂流性的過渡型，孵化過程中發(fā)現(xiàn)孵化桶的水流速度過低導致卵沉底；(3)未及時撈出發(fā)霉的死卵，越粘越多，極大地影響了其它卵。

蛇卵出現(xiàn)水霉病后雖可用藥物抑制治療，但存在殘留，對卵質量及魚苗的孵化有不良的影響。張厚冰[20]在水霉抑制藥物對河川沙塘鱧受精卵孵化的影響的研究中表明用4%的鹽水并保持相對較高的溫度和手工處理是保證高孵化率的有效措施，所以防治水霉病應該從改進孵化桶、手工處理及提高受精卵質量等方面著手。本次試驗中通過用小型密撈網(wǎng)及時撈出死卵和在孵化桶進水口處安裝分流裝置，水流沿著桶壁向上沖的方式降低卵的發(fā)病率，取得了良好的效果。

3.3 蛇仔魚全長、頭長、軀干長及尾長的異速生長

魚類在長期進化中形成了優(yōu)先發(fā)育重要功能器官的資源分配策略，其目的是提高生存能力與維持種群持續(xù)繁衍。實驗表明蛇仔魚在早期發(fā)育過程中存在異速生長的模式，與其它魚類存在一些差距。

本實驗研究發(fā)現(xiàn),蛇仔魚下塘時攝食、游泳等器官已初步發(fā)育完成，由于天然餌料豐富及生長空間的擴大，10日齡后生長速率明顯增加(1.05 mm/d)。蛇仔魚頭部、軀干部及尾部表現(xiàn)為“U”型生長模式[22]，與青龍斑仔、稚魚一致[12]。蛇仔魚頭部表現(xiàn)為明顯的正異速生長，國內(nèi)外學者認為魚類早期階段優(yōu)先發(fā)育頭部，旨在為仔魚早期視覺、呼吸等器官的發(fā)育提供生長空間。類似的結果在大鱗副泥鰍(Paramisgurnusdabryanus)[16]、泥鰍(Misgurnus anguillicaudatus)[23]、中吻鱘(Acipensermedirostris)[24]等研究中已得到證實。當蛇頭部各器官發(fā)育完善后，頭部生長速度降低，逐漸接近于等速生長，與何勇鳳等[10]研究鱸鯉仔魚的結果一致。

蛇仔魚的軀干長表現(xiàn)為負異速生長，沒有生長拐點。大量研究表明魚類在早期發(fā)育階段軀干部表現(xiàn)為負異速生長，如中吻鱘[24]、江鱈(Lotalota)[25]等。這種異速生長模式使得身體更協(xié)調，減少了早期仔魚攝食運動的能耗。軀干部的生長包括消化系統(tǒng)的發(fā)育，完善腸道功能的過程相對緩慢。

蛇的尾長在早期發(fā)育階段表現(xiàn)為明顯的正異速生長，為尾鰭的生長發(fā)育提供了空間基礎。這進一步表明了優(yōu)先發(fā)育運動器官是自然水域中維持魚類存活、繁衍的重要保證，研究結果與美洲鰣(Alosasapidissima)[26]、施氏鱘[9]相似，這類研究認為尾鰭的正異速生長模式是由于尾鰭的分化引起的。前期蛇仔魚以間歇式的游動方式運動，無法保持平衡及維持在所處的水層。在孵化桶內(nèi)主要依靠尾部的擺動，進行垂直運動，并以這種方式攝食適口的餌料。大量研究報道表明同屬游泳器官的胸鰭表現(xiàn)為正異速生長，如施氏鱘[9]、青龍斑仔稚魚[12]等。但本次實驗結果表明蛇仔魚的游泳器官胸鰭為持續(xù)的負異速生長。分析認為可能是胸鰭在蛇早期發(fā)育過程中占次要地位，與其底棲及附著習性相關，故沒有優(yōu)先發(fā)育。與張云龍等[16]研究的大鱗副泥鰍結果一致。

3.4 蛇仔魚幾個外部器官的異速生長

蛇仔魚的吻部表現(xiàn)為正異速生長，與施氏鱘[9]、鱸鯉[10]和西伯利亞鱘[27]的研究報道相似。吻部的正異速生長一直持續(xù)到實驗結束，這期間口部的器官得到不斷地完善，有利于提高攝食能力。無生長拐點，可能由于實驗周期較短，未達到拐點所在的日齡。諸多研究表明由于仔魚開口后,由內(nèi)源性營養(yǎng)期進入混合營養(yǎng)階段，向外界攝食的食物比逐漸增大,吻部仍繼續(xù)生長,表現(xiàn)為正異速生長，以適合外界中不同類型的餌料[10，27]。蛇仔魚的眼徑在拐點前為等速生長(b=1)，4日齡后眼徑表現(xiàn)為負異速生長，為頭部其它器官的快速生長預留了空間。然而眼徑于拐點前表現(xiàn)為正異速生長的發(fā)育模式較為普遍，如大麻哈魚[11]、金頭鯛(Sparusaurata)[28]、歐洲鰉(Husohuso)[29]等。眼部的生長狀況直接影響到仔魚的攝食能力及避敵能力。為提高攝食效率，在頭部的發(fā)育有限空間內(nèi)，優(yōu)先發(fā)育眼睛，而后發(fā)育與攝食相關的器官(如吻長)。

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