大口黑鱸組織蛋白酶B基因SNP篩選及其與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析

李勝杰，周春龍，白俊杰,，吳建開，樊佳佳，費(fèi)志平，孫建國(guó)，馬冬梅

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部熱帶亞熱帶水產(chǎn)資源利用與養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510380；2.南京帥豐飼料有限公司，南京 211306；3.湖州湖旺水產(chǎn)種業(yè)有限公司，浙江湖州 313000；4.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430070)

組織蛋白酶(Cathepsin)屬于木瓜蛋白酶超家族半胱氨酸蛋白酶，具有蛋白質(zhì)的加工、修飾和調(diào)控應(yīng)答等生物學(xué)功能。Cathepsin B(CTSB)是最早被關(guān)注的組織蛋白酶[1]，該酶可降解肌球蛋白，且對(duì)肌動(dòng)蛋白的降解能力要小于肌球蛋白?；ǜ辊?Scomberaustralasicus)CTSB對(duì)肌原纖維蛋白產(chǎn)生明顯降解作用[2]。CTSB基因參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生[2-3]。CTSB基因在豬(Susscrofa)前體脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮調(diào)控作用，提高CTSB的表達(dá)，能促進(jìn)豬前體脂肪細(xì)胞分化[4]。CTSB基因的突變對(duì)肉質(zhì)和生長(zhǎng)性狀產(chǎn)生影響作用，如豬CTSB基因多態(tài)性與背膘厚顯著和日增重存在相關(guān)[5]，牛(BosTaurus)CTSB基因內(nèi)含子中的SNP位點(diǎn)與其體重和牛肉大理石紋性狀密切相關(guān)[6]。目前對(duì)于魚類CTSB的功能研究方面，鰱[7-8](Hypophthalmichthysmolitrix)、藍(lán)圓鲹(Decapterusmaruadsi)[9]和松江鱸[10](Trachidermusfasciatus)等魚類的CTSB基因序列已被克隆分離得到，且其活性得到證實(shí)，但關(guān)于魚類CTSB基因多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性研究還未見報(bào)道。

大口黑鱸(Micropterussalmoides)原產(chǎn)于美國(guó)和加拿大，1983年被引進(jìn)到我國(guó)大陸進(jìn)行養(yǎng)殖，現(xiàn)已成為國(guó)內(nèi)的名優(yōu)淡水經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖品種之一[11-12]。鑒于CTSB基因是影響生長(zhǎng)性狀的重要候選基因[13]，本研究從大口黑鱸CTSB基因中篩選SNP位點(diǎn)，并分析SNP位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性，為大口黑鱸分子標(biāo)記輔助育種提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)用的20尾大口黑鱸采自珠江水產(chǎn)研究所廣州水產(chǎn)良種基地，剪取每尾魚尾鰭，在-20 ℃條件下無水乙醇中保存，用于后續(xù)SNP位點(diǎn)的篩選。用于生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)分析的大口黑鱸采自佛山市南海區(qū)九江鎮(zhèn)金匯農(nóng)場(chǎng)。選擇500尾親魚群體繁殖，將同一天收集的約100萬受精卵孵化出的魚苗轉(zhuǎn)入池塘中進(jìn)行培育，將培育的大規(guī)格魚種放入面積為5 336 m2的池塘中喂養(yǎng)至成魚，8月齡時(shí)，從養(yǎng)殖群體中隨機(jī)挑選165尾，測(cè)量每尾魚的體質(zhì)量、全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、體高、尾柄長(zhǎng)和尾柄高等性狀值，并剪取尾鰭于-20 ℃條件下無水乙醇中保存。

1.2 SNP位點(diǎn)篩查

采用組織DNA提取試劑盒(廣州欣研生物科技有限公司)提取鰭條DNA。根據(jù)文獻(xiàn)[14]中CTSB基因(GenBank：KJ160497)序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，正反向引物序列分別為 5′-ACACTAAAAGCTCCCTCCACT-3′和5′- GCCAAGGTTAGCGTAGAGAT-3′，引物由廣州吉格生物科技有限公司合成。PCR擴(kuò)增程序的參數(shù)設(shè)置為：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s， 72 ℃ 90 s，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于4 ℃條件下保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)符合預(yù)期條帶后由上海博尚生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，采用Vector NTI軟件比對(duì)分析序列并篩選SNP標(biāo)記。

1.3 SNP位點(diǎn)的基因型分析

將提取的鰭條組織DNA和已獲得的SNP位點(diǎn)相關(guān)信息送往上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行SnaPshot分型，具體流程如下：根據(jù)目標(biāo) SNPs 側(cè)翼序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物(P1：5′-TGAGTCATATGAAAGCATTAC-3′和P2：5′-ACACTTTGTGTATGCAGGCTG-3′)，然后對(duì)每個(gè)樣品的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增后取3 μL PCR產(chǎn)物用ExoI和FastAP純化，主要是用ExoI去除反應(yīng)產(chǎn)物中的剩余引物，用FastAP去除反應(yīng)中剩余的DNTP，37 ℃條件下15 min，80 ℃高溫滅活ExoI和FastAP酶15 min。根據(jù)ABI公司提供的SnaPshot試劑盒，用延伸引物進(jìn)行延伸反應(yīng)，使用ABI公司的PRISM 3730測(cè)序儀進(jìn)行基因分型。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

遺傳參數(shù)用POPGENE32軟件計(jì)算。采用SPSS17軟件中一般線性模型分析SNP位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性，統(tǒng)計(jì)分析模型采用Yij=μ+Gi+eij，Yij為某個(gè)性狀第i個(gè)標(biāo)記第j個(gè)個(gè)體表型值；μ為統(tǒng)計(jì)分析中所有個(gè)體的平均表型值；Gi為SNP標(biāo)記的效應(yīng)值；eij為對(duì)應(yīng)于表型值的隨機(jī)殘差效應(yīng)值[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大口黑鱸CTSB基因序列和SNP位點(diǎn)篩查

PCR擴(kuò)增后獲得的目的片段約為1 390 bp，經(jīng)測(cè)序和比對(duì)確認(rèn)擴(kuò)增片段為大口黑鱸CTSB基因序列。該基因包含3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子，編碼區(qū)序列由990個(gè)堿基組成，共編碼330個(gè)氨基酸。將20個(gè)樣品的序列進(jìn)行比對(duì)分析，在外顯子3上篩選到一個(gè)G/C突變位點(diǎn)，依據(jù)其所在序列中的位置和堿基類型命名為C+598G。

將大口黑鱸CTSB基因編碼區(qū)序列與GeneBank中已登錄的魚類CTSB基因進(jìn)行比較，與條石鯛(Oplegnathusfasciatus，HM060314.1)的同源性最高，其核苷酸同源性為91%，與金頭鯛(Sparusaurata，KJ524457.1)、許氏平鲉(Sebastesschlegelii，AB490961.1)、點(diǎn)帶石斑魚(Epinepheluscoioides，KC832926.1)、伯氏樸麗魚(Haplochromisburtoni，XM_005915065.1)、牙鲆(Paralichthysolivaceus，AY686604.1)、青鳉(Oryziaslatipes，XM_020699636.1)、秀美花鳉(PoeciliaFormosa，XM_007549749.2)和彈涂魚(Boleophthalmuspectinirostris，XM_020938756.1)的核苷酸同源性分別為89%、88%、87%、86%、84%、84%和81%。C+598G突變位點(diǎn)除大口黑鱸具有G和C兩種堿基外，其他魚類在該位點(diǎn)的堿基均為G(圖1)，該堿基的突變使原來編碼甘氨酸的GGT突變?yōu)榫彼岬拿艽a子CGT，甘氨酸屬中性氨基酸，而精氨酸屬于堿性氨基酸。

圖1 不同魚類中C+598G突變位點(diǎn)附近序列的比對(duì)(C+598G位點(diǎn)處所比對(duì)的堿基采用方框標(biāo)記)Fig.1 The sequence alignment among different fishes for sequence nearby C+598G mutation site(the basic group compared in C+598 site was labeled by oblong box )

2.2 SNP位點(diǎn)在群體中的遺傳結(jié)構(gòu)分析

采用SnaPshot分型方法分析C+598G位點(diǎn)在165尾大口黑鱸個(gè)體中的基因型，統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，C等位基因的頻率為64.24%，G等位基因的頻率為35.76%，3種基因型GG、GC、CC的頻率分別為40.6%、47.3%和12.1%。該位點(diǎn)的觀測(cè)雜合度度(Ho)、期望雜合度(He)和有效等位基因數(shù)(Ne)分別為0.473、0.461和1.85。經(jīng)哈代-溫伯格平衡卡方檢驗(yàn)，該位點(diǎn)符合哈代-溫伯格平衡定律(P>0.05)。C+598G位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)為0.354，當(dāng)PIC值介于0.25～0.5時(shí)被認(rèn)為屬于中度多態(tài)性[16-17]。

2.3 C+598G位點(diǎn)與生長(zhǎng)性狀關(guān)聯(lián)分析

C+598G位點(diǎn)3種基因型與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性分析結(jié)果見表1，3種基因型個(gè)體在體質(zhì)量、全長(zhǎng)、體長(zhǎng)、體高、尾柄長(zhǎng)和尾柄高等6個(gè)性狀上的平均值大小關(guān)系分別為：CC型>CG型>GG型，其中CC型與GG型在體質(zhì)量上存在顯著差異(P<0.05)，CC型個(gè)體的平均體質(zhì)量比GG型個(gè)體增重66.68g，提高了15.31%。

注：表中數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，同一列不同上標(biāo)字母表示差異顯著(P<0.05)

3 討論

組織蛋白酶B是動(dòng)物體內(nèi)重要的內(nèi)源蛋白酶，屬于木瓜蛋白酶超家族的半胱氨酸蛋白酶[18]。CTSB基因?qū)υS多生理過程均具有調(diào)節(jié)作用。本研究將大口黑鱸CTSB基因的編碼區(qū)序列與條石鯛等多種魚類的CTSB 基因編碼區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)大口黑鱸CTSB基因核苷酸序列與這些魚類序列之間的同源性在81%到91%之間，具有較高的同源性，說明CTSB這類木瓜蛋白酶家族在魚類的進(jìn)化上也與其他物種一樣具有很高的保守性，受到高度的進(jìn)化限制，發(fā)揮重要的生理生化功能。

Russo等[5]在豬CTSB基因內(nèi)含子上篩選到3個(gè)SNP位點(diǎn)，鄧桂馨等[6]在黃牛CTSB基因內(nèi)含子6中篩選到1個(gè)SNP位點(diǎn)，而本研究首次在大口黑鱸CTSB基因外顯子上篩選到1個(gè)SNP位點(diǎn)，對(duì)該位點(diǎn)在165尾大口黑鱸養(yǎng)殖樣本中的基因型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，CC、GC和GG型個(gè)體數(shù)分別為67、78 和20尾，其中GC雜合子占到47.3%，這可能與群體本身具有較豐富的遺傳多樣性有關(guān)。等位基因頻率分析結(jié)果表明，C等位基因頻率為64.2%，屬于有利基因，且CC型對(duì)生長(zhǎng)性狀呈正相關(guān)，在生產(chǎn)應(yīng)用中，通過人工定向選擇基因型為CC純合子的親本，培育純合子品系，從而實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)基因型的快速富集。

已有研究表明，豬和牛CTSB基因存在SNP位點(diǎn)，且SNP位點(diǎn)與背膘厚、日增重和凈肉重顯著相關(guān)[5-6]。本研究結(jié)果表明，CTSB基因C+598G位點(diǎn)的CC型個(gè)體在體質(zhì)量、全長(zhǎng)、體高等多個(gè)生長(zhǎng)性狀上明顯優(yōu)于 GG型個(gè)體，其中CC型與GG型在體質(zhì)量上存在顯著差異，表明CTSB基因的多態(tài)性對(duì)大口黑鱸生長(zhǎng)性狀也產(chǎn)生影響作用。我們推測(cè)這是由于基因的單核苷酸突變，使原來編碼的甘氨酸突變?yōu)榫彼幔拾彼崤c精氨酸的物理性質(zhì)有所不同，前者是中性氨基酸而精氨酸為堿性氨基酸，這種變化可能導(dǎo)致其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化，進(jìn)而影響了蛋白的功能。這種由于一個(gè)編碼堿基的突變改變了氨基酸的種類而使性狀發(fā)生了明顯改變，可作為高效的分子標(biāo)記應(yīng)用于分子育種，如皮爾蒙特牛和比利時(shí)藍(lán)牛肌肉生長(zhǎng)抑素(myostatin)基因的G/A轉(zhuǎn)換，引起氨基酸由半胱氨酸轉(zhuǎn)換為酪氨酸，該突變使牛表現(xiàn)出雙肌性狀并使產(chǎn)肉量提高[19]。

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