低能量體外沖擊波對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細胞凋亡的影響

高宏梁 周新華 吳猛 李建有

[摘要] 目的 觀察低能量體外沖擊波（ESW）對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細胞凋亡的影響。 方法 將30只裸大鼠按隨機數(shù)字表法分為空白組（n=10）、模型組（n=10）、低能量ESW組（n=10）；模型組與低能量ESW組均建立KOA模型，空白組不予以建模；建模6周后，拆除石膏，低能量ESW組予以低能量（0.1 mJ/mm2）ESW治療，沖擊1000次。4周后，處死大鼠，行組織形態(tài)大體觀察及染色觀察，并采用TENUL方法對軟骨細胞凋亡情況進行檢測。結(jié)果 干預(yù)4周末，空白組軟骨外觀顯光亮藍白色，無裂痕、缺損，軟骨結(jié)構(gòu)、潮線顯示清楚；模型組膝關(guān)節(jié)呈現(xiàn)典型的KOA病理改變；而低能量ESW組軟骨觸摸有軟化，少許脫落，潮線模糊。低能量ESW組Moran評分為（5.93±0.71）分，明顯高于模型組的（4.32±0.76）分（P<0.05）；低能量ESW組Mankin評分、細胞凋亡率分別為（8.03±1.07）分、（12.12±1.59）%，均明顯低于模型組的（9.78±1.76）分、（14.25±2.23）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 低能量ESW可有效抑制KOA大鼠軟骨細胞凋亡，對KOA治療有重要參考價值。

[關(guān)鍵詞] 低能量體外沖擊波；膝骨關(guān)節(jié)炎；軟骨細胞；凋亡

[中圖分類號] R684.3 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2018）01-0032-04

Effects of low energy extracorporeal shock wave on chondrocytes apoptosis in rats with knee osteoarthritis

GAO Hongliang ZHOU Xinhua WU Meng LI Jianyou

Department of Orthopedics，Huzhou Central Hospital in Zhejiang Province， Huzhou 313003，China

[Abstract] Objective To observe the effects of low energy extracorporeal shock wave（ESW） on chondrocyte apoptosis in rats with knee osteoarthritis. Methods The 30 nude rats were divided into the blank group（n=10），the model group （n=10） and the low energy ESW group（n=10） by random number table method. The model group and the low energy ESW group were given the establishment of the KOA model，and the blank group was not modeled. After 6 weeks of modeling，the plaster was removed and the low energy ESW group was treated with low-energy（0.1 mJ/mm2） ESW with 1000 shocks. After 4 weeks，the rats were killed and the morphological observation and staining observation were carried out. The chondrocytes apoptosis was detected by TENUL. Results At the end of 4 week of intervention，there were bright blue cartilages without cracks and defects，and the clear cartilage structure and tidal line in the blank group. The typical KOA pathological changes were shown in the knee joint in the model group while the cartilage touch was softened with a little fell off，and the tidal line was blurred in the low energy ESW group. The score of Moran in the low energy ESW group was significantly higher than that in the model group[（5.93±0.71） points vs （4.32±0.76） points] （P<0.05）. The Mankin score and chondrocyte apoptosis rate were significantly lower than those in the model group [（8.03±1.07） points vs （9.78±1.76） points； （12.12±1.59）% vs （14.25±2.23）%] （P<0.05）. Conclusion Low energy ESW can effectively inhibit the chondrocytes apoptosis in KOA rats，and has important reference value for the treatment of KOA.

[Key words] Low energy extracorporeal shock wave； Knee osteoarthritis； Chondrocytes； Apoptosis

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是老年人常見病、多發(fā)病，在60歲以上人群中，男性、女性發(fā)病率分別為9.6%、18%[1]。目前KOA治療目的在于緩解患者疼痛等癥狀，但這些治療均無法有效阻止病情進展，患者最終需采取全膝人工關(guān)節(jié)置換術(shù)進行治療[2，3]。軟骨退變、損傷是KOA的基本病理改變，通過抑制軟骨細胞凋亡阻止疾病發(fā)展是一種治療新思路。目前關(guān)于促進軟骨缺損細胞修復(fù)的研究較多，但臨床始終缺乏改善軟骨損傷并取得理想遠期療效的治療手段。體外沖擊波（extracorporeal shock wave，ESW）是在運動醫(yī)學(xué)領(lǐng)域興起的一種非侵入性治療方法，針對不同疾病可采取不同能量治療[4]。由于治療時，關(guān)節(jié)軟骨常暴露于沖擊波范圍，沖擊波對關(guān)節(jié)軟骨的影響亦引起人們重視。動物研究表明，ESW對骨性關(guān)節(jié)炎（OA）有較好的療效，可有效減輕關(guān)節(jié)疼痛，并改善關(guān)節(jié)功能[5]。然而，關(guān)于ESW治療OA的遠期療效仍缺乏深入研究。本研究旨在觀察低能量ESW對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細胞凋亡的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物

SPF級雄性裸大鼠30只，體質(zhì)量150～220 g，月齡4～6個月，由北京維通利華實驗動物有限責任公司提供，動物編號：SCXK（滬）2015-0002；飼養(yǎng)于我院動物中心實驗室SPF環(huán)境中，溫度（24±2）℃，濕度30%～60%，常規(guī)自由飲食，每天日照12 h，通風良好。實驗時對實驗動物的處理方式符合動物倫理要求。

1.2實驗試劑

蘇木精購自美國Sigma-Aldrich，伊紅（水溶）購自上海撫生生物科技有限公司，甲苯胺藍購自北京華越洋生物科技有限公司，DAB顯色試劑盒購自上海威奧生物科技有限公司，細胞凋亡檢測試劑盒均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，AB-PAS結(jié)腸黏膜染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，山羊抗鼠IgG抗體-HRP多聚體、抗體稀釋液購自遼寧邁迪生物科技股份有限公司，DAB濃縮加強型試劑盒購自北京泰澤瑞達科技有限公司，甲醛、鹽酸、雙氧水、二甲苯、EDTA、75%乙醇、中性樹膠、PBS（自配）均為國家分析純。

1.3方法

1.3.1分組 2016年12月在我院OA研究重點實驗室進行實驗，對裸鼠進行編號并采用隨機數(shù)字表法分為三組，即空白組、模型組、ESW組，每組10只。

1.3.2建立模型 模型組與ESW組KOA模型均以改良伸直位固定法進行建立：采用棉墊對鼠左后肢固定區(qū)域進行包裹，接著采用管狀石膏予以固定，范圍由股骨上端到小腿關(guān)節(jié)上1 cm，待石膏硬化后，將鼠放回鼠籠，行單籠飼養(yǎng)?？瞻捉M不予以建模。

1.3.3干預(yù) 建模6周后，行石膏拆除，ESW組予以低能量（0.1 mJ/mm2）ESW治療1次，沖擊1000次。其他兩組不予以干預(yù)。

1.3.4關(guān)節(jié)取材 于干預(yù)后4周行空氣栓塞法，將大鼠處死，打開大鼠關(guān)節(jié)腔，明確踝關(guān)節(jié)軟骨部位后，采用鋒利刀片將其取出，并以10%甲醛溶液進行固定，24 h后置于混合酸脫鈣液中脫鈣10 d。之后經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋等過程，制作石蠟標本，并切成石蠟切片，厚度約為5 μm。依次行免疫組化法、蘇木精-伊紅染色法（HE）、AB-PAS染色液及甲苯胺藍染色，并應(yīng)用TUNEL法對細胞凋亡情況進行檢測。

1.4觀察指標

1.4.1組織形態(tài) （1）肉眼下對軟骨面情況進行觀察，包括關(guān)節(jié)黏連、軟骨表面修復(fù)與腐蝕、外觀等情況，行Moran評分[6]，具體評分標準如下：Ⅰ關(guān)節(jié)黏連，無（2分）、小而且疏松的纖維組織（1分）、大而且致密的纖維組織（0分）；Ⅱ軟骨表面修復(fù)情況，完全修復(fù)（2分）、部分修復(fù)（1分）、未修復(fù)（0分）；Ⅲ軟骨腐蝕情況，無（2分）、缺損區(qū)域或邊緣（1分）、缺損區(qū)域或鄰近的正常軟骨（0分）；Ⅳ軟骨外觀，半透明（2分）、不透明（1分）、變色或不規(guī)則（0分）。（2）HE染色、AB-PAS染色及甲苯胺藍染色后進行觀察，包括組織結(jié)構(gòu)、細胞、基質(zhì)著色、潮線等4個方面，行Mankin評分[6]，具體評分標準如下：Ⅰ結(jié)構(gòu)，正常（0分）、表面不規(guī)則（1分）、血管翳和表面不規(guī)則（2分）、裂隙達移行層（3分）、裂隙達放射層（4分）、裂隙達鈣化層（5分）、結(jié)構(gòu)完全紊亂（6分）；Ⅱ細胞，正常（0分）、彌散性細胞增多（1分）、細胞形成集落（2分）、細胞過多（3分）；Ⅲ基質(zhì)著色，正常（0分）、輕度減弱（1分）、中度減弱（2分）、重度減弱（3分）、完全未染色（4分）；Ⅳ潮線完整性，完整（0分）、有血管穿過（1分）。

1.4.2免疫組化法 石蠟切片作常規(guī)方法脫蠟至水，蛋白酶K（5 μg/mL），常溫下15 min。采用3% H2O2甲醇，常溫下孵育10 min；再加入0.1% Triton及0.1%枸櫞酸鈉，冰上反應(yīng)2 min。加50 μL TUNEL反應(yīng)液，置于37℃濕盒中孵育30 min；加50 μL POD，37℃濕盒中孵育60 min。滴入DAB顯色液，顯色10 min；HE染色法復(fù)染，以水洗凈。以75%鹽酸酒精分色，二甲苯透明，再采用中性樹脂膠進行封片，顯微鏡下觀察；光學(xué)顯微鏡下觀察，并顯微放大照相，實驗時設(shè)立陽性對照及陰性對照來確保染色結(jié)果真實性，胞核顯示黃色顆粒彌漫性分布，則判定為陽性（即為凋亡細胞），而被蘇木精復(fù)染呈藍色者為陰性。高倍鏡視野下計數(shù)陽性（黃染）及陰性（藍染）細胞核數(shù)，并計算細胞凋亡率；凋亡率=陽性細胞核數(shù)/（陽性細胞核數(shù)+陰性細胞核數(shù)）×100%。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS19.0軟件處理研究數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，多組比較采用方差齊性分析；P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1建模結(jié)果

建模6周末，模型組、ESW組的KOA大鼠膝關(guān)節(jié)可見充血、腫脹明顯，關(guān)節(jié)液混濁，量增多，軟骨處有潰瘍與裂隙，滑膜充血、水腫明顯。

2.2大體觀察結(jié)果

大鼠關(guān)節(jié)腔開啟后顯示：（1）空白組，軟骨外觀顯光亮藍白色，無裂痕、缺損，且表面未見纖維組織覆蓋；（2）模型組，關(guān)節(jié)外觀無光澤，呈暗黃色，軟骨觸感較軟，表面不光滑，有明顯殘損及骨贅，軟骨表面有大量疏松纖維組織覆蓋，表面部分修復(fù)；（3）ESW組，關(guān)節(jié)軟骨呈灰白色，表面可見增生，觸摸有軟化，少許脫落，軟骨表面有少量疏松纖維組織覆蓋，表面部分修復(fù)（封三圖1）。模型組與低能量ESW組Moran評分較空白組均明顯降低（P<0.05），而低能量ESW組較模型組Moran評分顯著升高（P<0.05）。見表1。

2.3染色結(jié)果

（1）空白組：軟骨外表光滑，表層梭形細胞排列整齊有序，中間層圓形細胞散在分布，柱狀層細胞致密排列，軟骨結(jié)構(gòu)、潮線顯示清楚，基質(zhì)染色未見消退。（2）模型組：軟骨變薄，細胞數(shù)目減少，排序紊亂，基質(zhì)染色顯著消退，潮線不全。（3）低能量ESW組：軟骨變薄，細胞排序紊亂，基質(zhì)染色有所減退，潮線稍顯模糊。見封三圖2～4。Mankin評分比較上，模型組、低能量ESW組均明顯高于空白組（P<0.05），而低能量ESW組顯著低于模型組（P<0.05）。見表1。

2.4軟骨細胞凋亡情況

空白組僅存在少許凋亡的軟骨細胞，而模型組與低能量ESW組較空白組凋亡細胞數(shù)目明顯多見。見封三圖5。軟骨細胞凋亡率比較上，模型組與低能量ESW組均明顯高于空白組（P<0.05），而低能量ESW組明顯低于模型組（P<0.05）。見表1。

3 討論

隨著人口老齡化不斷加劇，KOA已成為影響老年人日常生活能力的關(guān)鍵因素之一[7]。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在軀體疼痛、社會功能、心理健康等多個因素作用下，KOA患者生存質(zhì)量明顯降低[8]。KOA癥狀表現(xiàn)早期主要為活動不適或可感疼痛，隨著疾病進展，活動時疼痛逐漸突出，并轉(zhuǎn)變?yōu)槊浲矗踔脸霈F(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹、活動受限、肌肉萎縮等一系列癥狀。既往研究認為，KOA發(fā)病機制在于軟骨降解及關(guān)節(jié)邊緣骨贅生成，而近年眾多證據(jù)顯示，軟骨細胞退化及凋亡與KOA發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[9-11]。軟骨細胞在軟骨損傷、修復(fù)中發(fā)揮著重要作用。有研究[12]通過對比正常人群與KOA患者軟骨細胞發(fā)現(xiàn)，KOA患者較正常人軟骨細胞凋亡數(shù)目明顯增多，且軟骨細胞凋亡數(shù)目與KOA病情嚴重程度呈正相關(guān)，提示通過抑制軟骨細胞凋亡可能成為KOA治療的新思路。

近年研究發(fā)現(xiàn)，采用ESW治療OA可有效緩解疼痛癥狀。Revenaugh[13]對OA馬模型予以ESW治療，發(fā)現(xiàn)治療后疼痛指數(shù)明顯減輕，認為ESW經(jīng)麻木周圍神經(jīng)使得痛覺缺失，改善軟骨水腫而發(fā)揮緩解疼痛作用。Mattheolabakis等[14]通過采用ESW治療，使大鼠步行距離明顯改善，進一步指出其作用機制可能是下調(diào)降鈣素基因作用的坐骨神經(jīng)元受體，從而抑制痛覺產(chǎn)生。Souza等[15]發(fā)現(xiàn)，ESW可通過降低關(guān)節(jié)液中前列腺素E2水平而改善狗髖關(guān)節(jié)OA癥狀。Mcilwraith等[16]研究表明，ESW治療可有效減輕馬腕OA疼痛癥狀，并可能是通過減少關(guān)節(jié)內(nèi)P物質(zhì)合成而實現(xiàn)的。

根據(jù)沖擊波的能流密度可將ESW分為低、中、高三級，一般認為能流密度≥0.5 mJ/mm2為高能量ESW，能流密度≤0.1 mJ/mm2為低能量ESW。低能量ESW被認為安全性較高，不會對軟骨細胞產(chǎn)生毒害[17]。本研究采用低能量ESW治療后，實驗大鼠膝關(guān)節(jié)無紅腫、瘀斑等癥狀出現(xiàn)，表明低能量ESW安全性較高。但在采用高能量ESW治療時需謹慎，原因在于有研究發(fā)現(xiàn)采用能流密度為0.5 mJ/mm2的ESW治療后第4周大鼠OA膝關(guān)節(jié)出現(xiàn)部分軟骨細胞壞死的現(xiàn)象[18]。

關(guān)于ESW對延緩OA進展的機制至今仍未明確。目前認為，ESW發(fā)揮OA治療可能與促進血管再生、多種因子分泌、提高軟骨細胞增殖活性等多種因素有關(guān)[19，20]。實驗證實軟骨細胞對ESW具有較高敏感性，相關(guān)機制可能是通過一系列分子信號的級聯(lián)反應(yīng)，達到調(diào)控細胞生長、分裂、蛋白質(zhì)合成的目的。本研究采用TUNEL檢測軟骨細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，干預(yù)4周末模型組膝關(guān)節(jié)呈現(xiàn)典型的KOA病理改變，而低能量ESW組輕于模型組。進一步分析發(fā)現(xiàn)，低能量ESW組較模型組軟骨細胞凋亡率明顯降低，表明ESW可有效抑制軟骨細胞凋亡，從而延緩大鼠KOA的進展。

綜上所述，低能量ESW對大鼠KOA關(guān)節(jié)軟骨凋亡有抑制作用，延緩KOA進展。低能量ESW有望成為治療KOA的重要途徑，值得深入研究。

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（收稿日期：2017-10-09）