小檗堿活化AMPK-eNOS減輕油酸所致人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷

周 慧，劉 敬，侯文鋒，王堯清，張文彥，許 波，馬成俊，李 忌，孟慶國，孫喜靈，王振華,*

（1.煙臺大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，線粒體與健康衰老研究中心，山東 煙臺 264005；2.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆特種植物藥資源教育部重點實驗室，新疆 石河子 832002；3.煙臺大學(xué) 新型制劑與生物技術(shù)藥物研究山東省高校協(xié)同創(chuàng)新中心，分子藥理和藥物評價教育部重點實驗室，山東 煙臺 264005；4.濱州醫(yī)學(xué)院 山東省中醫(yī)證候研究重點實驗室，山東 煙臺 264003）

高脂飲食導(dǎo)致的肥胖成為21世紀(jì)威脅人類健康的重要因素之一，肥胖是引起Ⅱ型糖尿病、心血管疾病的主要因素，肥胖所引發(fā)的全身性、低水平的慢性炎癥可引起胰島素抵抗、高血壓、高血脂等一系列代謝綜合征。越來越多的證據(jù)顯示，脂毒性所導(dǎo)致的血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)功能障礙在其中發(fā)揮了橋梁作用。

血管內(nèi)皮在維持血管的結(jié)構(gòu)和功能方面有著重要的作用。生理狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞通過合成分泌一氧化氮（nitric oxide，NO）、環(huán)前列腺素和內(nèi)皮素等調(diào)節(jié)血管的張力，抑制血小板聚集和炎性細(xì)胞黏附[1-2]。外源性和內(nèi)源性因子導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能異常在包括動脈粥樣硬化[3]、糖尿病[4]、中風(fēng)[5]等諸多嚴(yán)重心腦血管事件中起關(guān)鍵作用。心腦血管事件最主要的危險因素是以高血脂為特征的脂代謝紊亂，血中高水平游離脂肪酸（free fatty acids，F(xiàn)FAs）導(dǎo)致的內(nèi)皮細(xì)胞損害可能是其始動因素。

食品中FFAs在臘肉、火腿、奶酪等風(fēng)味形成中起重要作用[6]。但肥胖和代謝綜合征等人群中血漿高FFAs與胰島素抵抗、代謝紊亂、慢性炎癥、NO信號通路異常以及內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān)[7]。油酸（oleic acid，OA）是一種不飽和脂肪酸，可抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活性，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞線粒體合成過量活性氧（reactive oxygen species，ROS），造成氧化脅迫損傷[8]。

小檗堿又稱黃連素，是一種季銨型異喹啉生物堿，它存在于毛茛科黃連（Coptis chinensis Franch.）及小檗科等4 個科10 個屬的許多植物中，在傳統(tǒng)醫(yī)藥中被廣泛應(yīng)用于痢疾和感染腹瀉的治療[9]。Lau等[10]發(fā)現(xiàn)小檗堿具有正性肌力抗心律失常作用。Kong等[11]發(fā)現(xiàn)其活化細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶上調(diào)低密度脂蛋白受體的表達，降低膽固醇。Wu等[12]發(fā)現(xiàn)小檗堿能夠減少脂多糖引發(fā)的白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附。Zhang Ming等[13]發(fā)現(xiàn)小檗堿可激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞能量感受器——單磷酸腺苷活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK），從而輕微改善棕櫚酸致臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞eNOS下調(diào)和NO分泌障礙（P＜0.05），但未能明顯改善棕櫚酸所致臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制的作用?？紤]到FFAs致動脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)功能障礙在心血管事件發(fā)生中起關(guān)鍵作用，本研究考察了小檗堿對油酸所致人主動脈內(nèi)皮細(xì)胞（human aorta endothelial cells，HAEC）增殖抑制和NO分泌受損及氧化脅迫的影響，以期為其用于改善脂毒性所致動脈內(nèi)皮結(jié)構(gòu)功能障礙提供初步數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HAEC購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，由煙臺大學(xué)線粒體與健康衰老中心傳代保存，復(fù)蘇后10 代以內(nèi)用于實驗。

鹽酸小檗堿水合物、OA 阿拉丁試劑（上海）有限公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 美國Gibco公司；噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國Sigma公司；兔抗Thr172磷酸化AMPK（p-AMPK）、總AMPK抗體 美國Cell Signaling公司；鼠抗β-actin抗體、兔抗p-eNOS（ser1177）抗體、鼠抗eNOS抗體 美國Abcam公司；甘油三酯（triglycerides，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒 南京建成生物工程研究所；100 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）溶液（ST506）、RIPA裂解液（P0013B）、P0009增強型二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白質(zhì)量濃度測定試劑盒、BeyoECL Plus P0018超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AE-31型熒光倒置顯微鏡 麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；SpectraMax Paradigm型多功能酶標(biāo)儀 美國美谷分子儀器有限公司；電泳槽、電泳儀 北京伯樂儀器廠；5200凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司；HC-3018R型高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

用含體積分?jǐn)?shù)10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖完全培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)細(xì)胞。

1.3.2 MTT法檢測細(xì)胞活力

[1 4]方法，取對數(shù)生長期細(xì)胞，以5×104mL－1的密度接種于96 孔板，每孔加100 μL，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的油酸（150、300、450、900 μmol/L）分別處理24、48、72 h，另設(shè)不含油酸的培養(yǎng)基作為正常對照組。小檗堿處理組：不同濃度（0、1、5、10、20 μmol/L）小檗堿處理24 h；小檗堿與油酸處理組：不同濃度小檗堿（0、1、5、10、20 μmol/L）預(yù)處理2 h，加入300 μmol/L的油酸繼續(xù)處理24 h，另設(shè)不含小檗堿與油酸的完全培養(yǎng)基作為正常對照組，并以正常對照組為1進行數(shù)據(jù)處理。每孔加入10 μL MTT（0.5 mg/mL）在37 ℃條件下繼續(xù)孵育4 h后，棄上清液，每孔加150 μL DMSO，37 ℃條件下振蕩15 min，使結(jié)晶物充分溶解，多功能酶標(biāo)儀在490 nm波長處測量吸光度。細(xì)胞活力按下式計算。

1.3.3 脂質(zhì)水平的測定

HAEC接種于6 孔板，長至80%融合，以不同濃度的油酸處理24 h后，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗1 遍，吸凈PBS，加入500 μL含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液，刮下孔內(nèi)的細(xì)胞，全部收集于1.5 mL離心管中，冰浴超聲30 s，按試劑盒說明書測定細(xì)胞內(nèi)TC、TG水平，采用BCA法測定蛋白質(zhì)量濃度，以1 mg蛋白質(zhì)校正TG、TC水平。

1.3.4 油紅O染色檢測HAEC脂滴形成

參照文獻[15]采用油紅O染色檢測HAEC脂滴形成。稱取油紅O干粉1.8 g加入到300 mL異丙醇中密封，置于37 ℃水浴中加熱，磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙?，過濾，母液可長期室溫保存，檢測時將油紅O與三蒸水以3∶2（V/V）的比列混合。藥物處理后，細(xì)胞用4%的多聚甲醛溶液固定30 min，用PBS清洗3 次，加油紅O檢測液染色1 h，再加入70%乙醇溶液浸洗1 min，PBS清洗2 次，顯微鏡觀察拍照。

1.3.5 NO含量的測定

NO含量的測定參照文獻[16]。HAEC培養(yǎng)于24 孔板，待細(xì)胞生長至80%融合時，更換含鹽酸小檗堿水合物的無血清培養(yǎng)基，處理2 h后，按照試劑盒說明書吸取細(xì)胞培養(yǎng)液進行測定。

1.3.6 DCFH-DA探針檢測細(xì)胞ROS

參照文獻[17]，利用2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichlorodi-hydrof l uorescein diacetate，DCFH-DA）探針檢測細(xì)胞ROS。HAEC培養(yǎng)于96 孔底透板，待細(xì)胞生長至80%融合時，加鹽酸小檗堿水合物處理30 min后，棄原培養(yǎng)液，PBS潤洗3 次，加入100 μL 5 μmol/L DCFH-DA PBS，37 ℃條件下避光孵育30 min，PBS清洗3 次，以除去未結(jié)合的熒光染料，用熒光酶標(biāo)儀（Ex/Em＝485/530 nm）測定各孔熒光值。

1.3.7 Western Blotting分析

HAEC接種于6 孔板，待細(xì)胞生長至80%融合，以不同濃度小檗堿預(yù)處理2 h后，補充油酸至終濃度為300 μmol/L，繼續(xù)孵育6 h，用預(yù)冷的PBS洗滌2 次，加入500 μL含1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液，刮下孔內(nèi)的細(xì)胞，全部收集至1.5 mL離心管中，冰浴超聲處理30 s，10 000×g離心10 min，收集上清液，BCA法檢測蛋白質(zhì)量濃度。樣品煮沸10 min致蛋白變性后，取30 μg蛋白樣品用于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析。根據(jù)膠的分離范圍，AMPK采用10%分離膠、eNOS采用8%的分離膠，統(tǒng)一采用5%濃縮膠分離蛋白進行分析。300 mA轉(zhuǎn)膜100 min至聚偏二氟乙烯膜，用5%脫脂乳粉封閉2 h，用1∶1 000稀釋的兔抗p-AMPK抗體和p-eNOS抗體4 ℃孵育過夜，TBST（tris buffered saline with Tween）溶液清洗3 次，每次10 min，再用1∶2 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)二抗室溫孵育1 h，TBST溶液洗滌3 次后，BeyoECL Plus試劑盒顯影，5200凝膠成像系統(tǒng)拍照，Gis ID軟件分析蛋白條帶的相對光密度值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗每個處理均設(shè)3 個平行孔，每組實驗重復(fù)3 次，結(jié)果以表示，用SPSS 22.0分析軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。組間統(tǒng)計學(xué)差異比較采用獨立樣本t檢驗，其中P＜0.05為具有統(tǒng)計學(xué)顯著性差異，P＜0.01為具有統(tǒng)計學(xué)極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 油酸暴露對HAEC活力的影響

圖1 油酸處理對HAEC增殖活力的影響Fig.1 Effect of oleic acid on proliferation viability of HAECs

由圖1可知，HAEC暴露于150～900 μmol/L油酸中，MTT比色測定顯示細(xì)胞增殖受到油酸濃度依賴性抑制，且隨暴露時間延長，細(xì)胞增殖抑制加劇。300 μmol/L的油酸處理HAEC 48 h，細(xì)胞增殖活力僅為0.52（P＜0.01）。

2.2 油酸處理對HAEC中TC和TG含量的影響

圖2 油酸處理對HAEC中TG（A）和TC（B）含量的影響Fig.2 Effect of oleic acid on TG (A) and TC (B) contents in HAECs

不同濃度的油酸處理HAEC，用TG、TC試劑盒測定其脂質(zhì)堆積情況，由圖2可知，油酸可濃度依賴性地增加HAEC內(nèi)TG和TC的含量，且具有統(tǒng)計學(xué)差異。

2.3 小檗堿對油酸致細(xì)胞增殖的干預(yù)作用

圖3 小檗堿單獨（A）和小檗堿聯(lián)合油酸（B）對HAEC增殖的影響Fig.3 Effect of berberine alone and in combination oleic acid on the proliferation of HAECs

由圖3A可知，用不同濃度的小檗堿處理HAEC 24 h后，濃度為1、5、10 μmol/L的小檗堿能夠促進細(xì)胞的增殖，但20、40 μmol/L小檗堿可明顯抑制HAEC增殖，表明過高濃度的小檗堿有一定的細(xì)胞毒性。由圖3B可知，小檗堿與300 μmol/L油酸聯(lián)合處理HAEC后，濃度為1、5、10 μmol/L的小檗堿可明顯改善油酸對HAEC增殖的抑制作用（P＜0.01），然而20 μmol/L小檗堿未表現(xiàn)出類似效果，表明低濃度小檗堿對油酸所致內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制有改善作用。

2.4 小檗堿對油酸所致HAEC內(nèi)TC、TG和脂滴形成的影響

由圖4可知，300 μmol/L油酸致HAEC內(nèi)TC和TG水平均明顯升高（P＜0.01）；小檗堿與油酸聯(lián)合處理，可濃度依賴性地抑制油酸暴露所致HAEC內(nèi)TG和TC水平的升高。

圖4 小檗堿對油酸所致HAEC內(nèi)TG （A）、TC（B）含量升高的影響Fig.4 Effect of berberine on the increase of TG (A) and TC (B)induced by oleic acid in HAECs

圖5 小檗堿對油酸所致的HAEC內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)形成的影響（400×）Fig.5 Effect of berberine (BER) on intracellular lipid accumulation induced by oleic acid (OA) in HAECs (400 ×)

由圖5可知，油紅O染色顯示空白對照組細(xì)胞基本不著色，300 μmol/L油酸處理24 h后HAEC著色明顯；小檗堿聯(lián)合油酸共同處理后，細(xì)胞內(nèi)脂滴密度和著色均明顯低于油酸處理組。結(jié)果表明，小檗堿可抑制油酸誘導(dǎo)的HAEC脂肪合成。

2.5 小檗堿對油酸所致HAEC的NO合成障礙的影響

圖6 小檗堿對油酸所致HAEC的NO合成障礙的影響Fig.6 Effect of berberine on NO secretion impairment induced by oleic acid in HAECs

合成和分泌NO是血管內(nèi)皮細(xì)胞的重要功能。由圖6可知，300 μmol/L油酸處理HAEC 2 h，可明顯降低細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的NO含量（P＜0.01）；小檗堿與油酸聯(lián)合處理后，明顯改善了油酸所致HAEC的NO含量降低（P＜0.01），且改善效果呈濃度依賴性。

2.6 小檗堿對油酸所致HAEC生成ROS的影響

圖7 小檗堿對油酸所致HAEC生成ROS的影響Fig.7 Effect of berberine on the increase of ROS induced by oleic acid in HAECs

血管內(nèi)皮細(xì)胞合成適量的ROS可作為信號分子調(diào)控多種重要的生理活動，但過量ROS可致內(nèi)皮細(xì)胞受氧化脅迫損傷。本實驗采用DCFH-DA熒光探針測定了HAEC內(nèi)ROS水平。圖7結(jié)果表明，以300 μmol/L油酸處理HAEC 30 min后，細(xì)胞內(nèi)熒光強度明顯升高（P＜0.01）；而小檗堿與油酸聯(lián)合處理，可濃度依賴性抑制油酸所致的熒光強度升高，表明小檗堿可改善油酸所致HAEC內(nèi)的氧化脅迫狀態(tài)。

2.7 小檗堿對油酸所致AMPK/eNOS通路下調(diào)作用的影響

圖8 小檗堿對油酸所致AMPK/eNOS通路下調(diào)作用的影響Fig.8 Effect of berberine on the down-regulation of the AMPK/eNOS signaling pathway induced by oleic acid in HAECs

AMPK是細(xì)胞能量代謝的感受器，在調(diào)控糖脂代謝偶聯(lián)和氧化還原平衡狀態(tài)方面起核心作用。在Ca2+-鈣調(diào)素存在下，AMPK可直接磷酸化eNOS的Ser 1177位點，激活其合成NO[18]。由圖8可見，HAEC暴露于油酸后，AMPK和eNOS的磷酸化水平均明顯降低（P＜0.01），小檗堿可濃度依賴性地改善油酸對AMPK/eNOS活化的下調(diào)作用。AMPK抑制劑Compound C與小檗堿聯(lián)合應(yīng)用，完全抑制了小檗堿對AMPK和eNOS磷酸化的上調(diào)作用，AMPK激活劑AICAR與小檗堿聯(lián)用，未進一步增強小檗堿活性，表明小檗堿激活eNOS和促進NO合成與激活A(yù)MPK相關(guān)。

3 討 論

完整的血管內(nèi)皮系統(tǒng)作為血液與組織的一線屏障，在維護血管通透性、分泌多種血管活性物質(zhì)調(diào)控血流動力學(xué)等方面起關(guān)鍵作用。動脈血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能受損是血管反應(yīng)性降低，動脈粥樣硬化及血栓形成的始動因素。血漿中高FFAs導(dǎo)致的動脈血管內(nèi)皮系統(tǒng)損害與胰島素抵抗、慢性炎癥應(yīng)激、高血壓和心腦血管事件發(fā)生具有直接相關(guān)性，但脂毒性介導(dǎo)的血管內(nèi)皮結(jié)構(gòu)功能損害的確切機制仍未闡明，臨床亦未有理想的干預(yù)措施。油酸作為食品中廣泛存在的單鏈不飽合脂肪酸，近年亦發(fā)現(xiàn)其損害微血管內(nèi)皮細(xì)胞合成NO的能力，促進線粒體ROS生成，造成血管內(nèi)皮細(xì)胞損害[19]。氧分子通過單電子還原生成的超氧離子（）可與NO直接反應(yīng)形成ONOO-，降低NO的生物利用度，也可導(dǎo)致ROS解偶聯(lián)后生成更多的。因此，本研究選用油酸暴露使HAEC受脂毒性損害，考察了油酸對細(xì)胞增殖、脂質(zhì)合成、NO釋放和ROS生成的影響，發(fā)現(xiàn)油酸可濃度依賴性地抑制HAEC的增殖，300 μmol/L油酸明顯促進HAEC內(nèi)脂質(zhì)合成，提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平，抑制NO分泌，表明油酸可造成HAEC結(jié)構(gòu)和功能的損害。

近年來發(fā)現(xiàn)細(xì)胞能量感受器AMPK信號系統(tǒng)在維持細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)和適應(yīng)性反應(yīng)中扮演關(guān)鍵角色[21]。在肥胖、代謝綜合征和糖尿病等代謝性疾病中，活化AMPK能夠抑制脂肪酸和TG的合成，并且刺激脂肪酸氧化和線粒體的生物合成，從而抑制氧化應(yīng)激狀態(tài)和胰島素抵抗發(fā)生，改善腹型肥胖和高血壓等病理進程[22]。Deng等[23]研究證實脂聯(lián)素可以通過AMPK/eNOS通路來改善肥胖大鼠血管內(nèi)皮功能紊亂。Guo等[24]發(fā)現(xiàn)小分子AMPK激活劑可明顯改善代謝綜合征動物模型脂代謝紊亂的癥狀，降低血液和肝臟中TG和TC水平。本研究中發(fā)現(xiàn)油酸處理HAEC對總AMPK蛋白表達未有明顯影響，但可明顯下調(diào)其磷酸化水平，同時eNOS磷酸化水平也相應(yīng)下調(diào)，小檗堿可濃度依賴性地改善油酸對AMPK/eNOS活化的抑制作用。Wang Qilong等[25]對比研究了敲除AMPKα2對高脂飲食致ApoE-/-小鼠動脈硬化形成的影響及小檗堿的干預(yù)作用，發(fā)現(xiàn)AMPKα2介導(dǎo)的線粒體生物合成和解偶聯(lián)蛋白UCP2表達與小檗堿減少動脈硬化的形成相關(guān)。Zhang Ming等[13]采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為受試對象，初步證實了小檗堿通過活化AMPK/eNOS通路，改善了棕櫚酸對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞NO分泌及氧化脅迫損害的干預(yù)作用，但仍缺乏小檗堿對動脈內(nèi)皮細(xì)胞脂毒性干預(yù)作用的證據(jù)。但Guo Ting等[26]在采用小檗堿干預(yù)高脂喂養(yǎng)小鼠所致肝臟脂肪變性的研究中，未觀察到小檗堿對AMPK磷酸化水平有明顯影響，僅見其對JNK1磷酸化的下調(diào)作用。Chen Weijia等[27]發(fā)現(xiàn)小檗堿預(yù)處理可明顯改善腦缺血再灌注損傷所導(dǎo)致的腦損傷及神經(jīng)元凋亡，但下調(diào)了AMPK的磷酸化水平。目前，尚未闡明小檗堿調(diào)控不同組織AMPK差異的分子機制，值得深入探究。

高水平FFAs可通過活化NF-κB炎癥信號通路，下調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞胰島素受體亞基1對eNOS的磷酸化，抑制NO合成，介導(dǎo)了血管內(nèi)皮的脂毒性損害[28]。本研究中觀察到油酸下調(diào)了AMPK和eNOS的磷酸化水平，而小檗堿可明顯抑制油酸對AMPK/eNOS磷酸化的下調(diào)作用，從而劑量依賴性地促進HAEC分泌NO。AMPK抑制劑Compound C可明顯拮抗小檗堿活化AMPK/eNOS，但AMPK激活劑AICAR未能進一步增強小檗堿對AMPK的活化作用，表明小檗堿通過激活A(yù)MPK信號活化了eNOS，從而改善了油酸對HAEC的脂毒性。

綜上所述，小檗堿可以改善油酸導(dǎo)致的HAEC損傷，其機制與其拮抗油酸下調(diào)AMPK/eNOS信號通路和促進內(nèi)源性NO合成相關(guān)。小檗堿一方面可減少血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)堆積；另一方面可抑制ROS生成，增加NO分泌，這些結(jié)果為小檗堿防治肥胖相關(guān)心血管疾病的發(fā)生提供了重要的實驗依據(jù)。

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