干細(xì)胞源性外泌體在心血管疾病中的研究進(jìn)展

關(guān)夢(mèng)珊 丘玉平 董鳳英 李瑩 謝志泉

1廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科（廣州510030）；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)（廣州510030）；3廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院干部病房四科（廣州510030）

干細(xì)胞具有很高的自我更新能力和多種分化潛能，可用于治療心血管疾?。–ardiovascular diseases，CVD）。然而仍存在著許多障礙，現(xiàn)有的干細(xì)胞修復(fù)受損組織的能力有限，并且它們?cè)谛呐K中存活時(shí)間有限（僅幾天）。VAN BERLO等[1]發(fā)現(xiàn)，在小鼠移植的心臟干細(xì)胞（Cardiac stem cells，CSCs）中僅有0.003%能夠直接分化為新心肌細(xì)胞。最近的研究表明，多種干細(xì)胞的生物學(xué)特性并不依賴(lài)于它們自身的增殖，而是依賴(lài)于它們的內(nèi)分泌和旁分泌活性物質(zhì)。干細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以直接與靶細(xì)胞膜融合，釋放RNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，也可以通過(guò)識(shí)別并結(jié)合靶細(xì)胞表面的特異性受體來(lái)調(diào)節(jié)微環(huán)境并逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)展。與其他細(xì)胞相比，干細(xì)胞具有通過(guò)核體途徑產(chǎn)生外泌體的強(qiáng)大能力，并且外泌體能夠模擬來(lái)源細(xì)胞的某些功能。CSCs和心臟祖細(xì)胞源性外泌體（CPC?derived exosomes，CPC?exo）具有與心臟細(xì)胞系統(tǒng)相似的遺傳背景，這種相似性為降低免疫排斥反應(yīng)提供了可能性[2]。此外，MSCs經(jīng)過(guò)體外多代培養(yǎng)產(chǎn)生外泌體池，有趣的是，從培養(yǎng)的干細(xì)胞中除去外泌體可以顯著削弱干細(xì)胞的保護(hù)作用[3?4]，從而表明外泌體是干細(xì)胞的關(guān)鍵活性成分。外泌體是干細(xì)胞分泌作用的典型代表，并在疾病治療中廣泛應(yīng)用于細(xì)胞信號(hào)和生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)。本文從生理和疾病兩方面綜述了干細(xì)胞源性外泌體在心血管系統(tǒng)中的研究現(xiàn)狀。此外，本文還介紹了外泌體作為疾病生物標(biāo)志物的應(yīng)用，以及外泌體在生殖醫(yī)學(xué)中的生物潛力。

1 外泌體的特性和功能

1.1 外泌體的結(jié)構(gòu)細(xì)胞間相互作用方式不僅包括釋放蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和其它分子介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞外受體，還包括通過(guò)囊泡將m RNA、mi RNA和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞中。20世紀(jì)80年代，在綿羊的紅細(xì)胞中首次發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外囊泡（Extracellular vesicles，EVs）[5]，當(dāng)時(shí)，分泌EVs被認(rèn)為是一種細(xì)胞處理廢物的方法。后來(lái)的研究表明，細(xì)胞外分泌是一種重要的細(xì)胞間交流方式，發(fā)生在許多生理和病理過(guò)程中，包括哺乳和免疫反應(yīng)。外分泌過(guò)程還參與調(diào)節(jié)某些疾病，例如CVD、神經(jīng)變性損傷和腫瘤。根據(jù)細(xì)胞來(lái)源和大小，EVs可分為3種類(lèi)型：外泌體（直徑范圍為40～100 nm）、微泡（直徑范圍為100～1000 nm）和凋亡小體（直徑范圍為1 ～ 5 μm）[6?7]。

外泌體富含膽固醇和鞘磷脂，是定義明確的EVs，由溶菌酶顆粒倒置形成的多囊體與細(xì)胞膜融合后分泌到細(xì)胞外，即形成了外泌體。由于其特殊的結(jié)構(gòu)，外泌體呈現(xiàn)高水平的細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性蛋白，與它的組織和細(xì)胞起源密切關(guān)聯(lián)。這些蛋白包括整合素和四重跨膜蛋白家族（CD63、CD89、CD81、CD9和 CD82）、細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性蛋白 Alix和tsg101、熱休克蛋白HSP70和HSP90、膜連接蛋白膜聯(lián)蛋白和脂筏特征蛋白Floatilin等[8]。不同細(xì)胞來(lái)源的外泌體具有不同的蛋白質(zhì)組成成分：腸上皮細(xì)胞來(lái)源的外泌體含有多種代謝酶和腸組織特異性A33抗原；B細(xì)胞來(lái)源的外泌體富含CD86和MHC分子；T細(xì)胞來(lái)源的外泌體具有促凋亡FASL受體。

除蛋白質(zhì)外，外泌體還含有具有生物活性的遺傳物質(zhì)，包括信使RNA（m RNA）、微RNA（mi RNA）和小干擾RNA（si RNA）。在心肌細(xì)胞衍生的外泌體中，已經(jīng)鑒定出1520種m RNA[9]，其中，發(fā)現(xiàn)mi RNA不僅是遺傳信息的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子，而且是調(diào)節(jié)細(xì)胞間通訊的生物標(biāo)記物。外泌體和靶細(xì)胞之間的相互作用是非常特異的，例如，血小板衍生的外泌體靶向作用于內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，而中性粒細(xì)胞衍生的外體靶向作用于血小板、巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞[10]。外泌體靶向作用分3種類(lèi)型：（1）外泌體直接與靶細(xì)胞膜融合，然后直接將m RNA、mi RNA和si RNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中；（2）外泌體通過(guò)胞吞作用被靶細(xì)胞攝??；（3）外泌體辨別并結(jié)合靶細(xì)胞表面上的特異性受體。外泌體表面存在多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子，其中大多數(shù)含有活性脂質(zhì)成分，包括鞘氨醇?1?磷酸（S1P）和神經(jīng)酰胺?1?磷酸（C1P），當(dāng)外泌體進(jìn)入靶細(xì)胞時(shí)，這些因子可抑制細(xì)胞凋亡和刺激血管生成[11]，同時(shí)，也將外泌體所含的mi RNA轉(zhuǎn)移到了受體細(xì)胞。在這個(gè)過(guò)程中，既傳遞了遺傳信息同時(shí)又調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。例如，活化的巨噬細(xì)胞通過(guò)增加外泌體中mi RNA?150的含量，從而抑制mi RNA?150靶基因c?Myb在內(nèi)皮細(xì)胞中的翻譯來(lái)刺激內(nèi)皮細(xì)胞遷移[12]。

1.2 干細(xì)胞源性外泌體與心血管疾病動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中，微鈣化是指通過(guò)傳統(tǒng)成像方法檢測(cè)到的鈣化，其存在于易損斑塊的纖維帽中，并且是斑塊不穩(wěn)定性的決定因素之一[13]。幾項(xiàng)前瞻性研究表明，動(dòng)脈鈣化程度與心血管不良事件的發(fā)生率呈負(fù)相關(guān)。HUTCHESON等[14]發(fā)現(xiàn)，人纖維帽中鈣化的形成途徑包括外泌體鈣化、微鈣化形成和大鈣化形成。其中，外泌體的內(nèi)容物主要包括蛋白質(zhì)和RNAs，尤其是mi RNAs能有效地改變體細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄，可能是CVD中的關(guān)鍵串?dāng)_因子。此外，在不同刺激下，外泌體表面蛋白可用于鑒別其來(lái)源，并通過(guò)相關(guān)的抗炎或炎性蛋白影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展[15]。

在以往的研究中，人們?cè)噲D通過(guò)干細(xì)胞源性外泌體改善急性心肌梗死（Acute myocardial infarction，AMI）的預(yù)后。眾所周知，外周血肌鈣蛋白水平已被用作急性心肌梗死早期診斷的生物標(biāo)志物，然而最近的研究[16]表明，血漿外泌體相關(guān)mi RNAs水平也可作為AMI診斷的新生物標(biāo)志物。心肌組織中含有多種外泌體相關(guān)mi RNA，如mi RNA?1，mi RNA?208b，mi RNA?133 a/b和mi RNA?499等。CORSTEN等[17]已經(jīng)確定AMI患者血漿中循環(huán)mi RNA?208b和mi RNA?499高度升高，而另一項(xiàng)研究在AMI患者中檢測(cè)到多種 p53 相關(guān)的 mi RNAs[18，19]。除了診斷 AMI外，包括MSC源性外泌體（MSC?exo）在內(nèi)的幾項(xiàng)臨床前研究也證實(shí)了其在AMI治療中的有益作用。在豬缺血再灌注模型中，MSC?exo減少梗塞范圍，改善心功能[20]；AR?SLAN等[20]將人MSC?exo移植入小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)AMI面積減少，心功能明顯改善。此外，AMI后心臟組織中腺嘌呤核苷酸水平顯著升高，進(jìn)一步的研究表明，經(jīng)外泌體治療后，心肌組織中p?AKT和糖原合酶激酶3顯著升高，活性氧（ROS）減少[22]。YU 等[23]首先將鋅指轉(zhuǎn)錄因子?4（zinc fin?ger tran?scription factor?4 ，GATA?4）過(guò)表達(dá)到MSCs中并提取MSC?exo，他們發(fā)現(xiàn)MSC?GATA?4?exo能顯著減少急性心肌梗死面積，這類(lèi)外泌體富含mi RNA，尤其是mi RNA?19a，可降低磷酸酶和PTEN水平，激活A(yù)KT和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶。

另一個(gè)缺血性心臟病小鼠模型中，缺氧促進(jìn)了CPC?exo的釋放，進(jìn)一步改變遺傳物質(zhì)的組成并顯著降低組織生長(zhǎng)因子、波形蛋白以及I型和III型膠原的表達(dá)[24]；進(jìn)一步的研究證實(shí)低氧誘導(dǎo)的CPC?exo富含mi R?17、mi R?199 a、mi R?210和mi R?292，并通過(guò)抑制纖維化的途徑保護(hù)心臟功能[25]。有研究報(bào)告了載有 mi RNAs的CPC?exo，例如GATA 4反應(yīng)性mi R?451，對(duì)心臟具有保護(hù)作用[26]。然而，祖細(xì)胞或CSCs?exo在心臟保護(hù)中的作用機(jī)制是通過(guò)特定mi RNA的直接作用，還是通過(guò)不同mi RNA之間的相互作用來(lái)介導(dǎo)，仍需要探索。

再灌注治療在搶救缺血心肌的同時(shí)，常常引起心肌缺血再灌注損傷，導(dǎo)致原缺血、缺氧加重。這可能與血管再通過(guò)程中ROS、炎癥、鈣超載和線(xiàn)粒體轉(zhuǎn)運(yùn)孔開(kāi)放有關(guān)[27]。MSC?exo通過(guò)傳遞某些蛋白質(zhì)和mi RNA，調(diào)節(jié)能量代謝，防止鈣超載，抑制死亡受體途徑，激活生存途徑。CABAL?HIERRO 等[27]表明 MSC?exo可通過(guò)抑制腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）而減少細(xì)胞凋亡。SUZUKI等[28]證實(shí)MSC?exo通過(guò)影響哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（m TOR）和自噬相關(guān)蛋白（ATG13）來(lái)降低自噬。因此，外泌體mi RNAs是否對(duì)心肌缺血再灌注損傷也有保護(hù)作用，有待進(jìn)一步闡明。

隨著經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療和外科旁路移植術(shù)的發(fā)展，AMI患者的生存率明顯提高。然而，失去功能的心肌細(xì)胞往往誘發(fā)心室重構(gòu)，并導(dǎo)致AMI后的心力衰竭，長(zhǎng)期預(yù)后不容樂(lè)觀。在心衰早期，與p53基因相關(guān)的微小 RNAs（mi R?192、mi R?194和 mi R?34a）顯著增加[19]，其中 mi R?194和 mi R?34a主要包裹在外泌體中，由心肌細(xì)胞主動(dòng)分泌進(jìn)入外周循環(huán)。因此，mi RNAs在循環(huán)中與左心室舒張功能顯著相關(guān)，可用作潛在的生物標(biāo)志物[30]。

2 外泌體的優(yōu)缺點(diǎn)

外泌體的應(yīng)用具有許多優(yōu)點(diǎn)。（1）與干細(xì)胞移植相比，外泌體不太可能促進(jìn)腫瘤發(fā)展。（2）外泌體無(wú)明顯不良反應(yīng)，如較少出現(xiàn)發(fā)熱、過(guò)敏反應(yīng)、溶血性反應(yīng)等。（3）外泌體攜帶的蛋白質(zhì)可產(chǎn)生更強(qiáng)的生物效應(yīng)。雖然外泌體有許多顯著的優(yōu)點(diǎn)，但在應(yīng)用方面也有一定限制[31]。（1）提取過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，提取量也是有限的。經(jīng)典的高速離心法提取胞外泌體需要很長(zhǎng)時(shí)間，因此，迫切需要建立提高產(chǎn)量的辦法。（2）除了保護(hù)因子外，外泌體中同時(shí)還存在多種有害成分，因此，增加保護(hù)因子的表達(dá)，人工修飾和減少外泌體中的有害成分，具有重要意義。（3）由于通過(guò)靜脈內(nèi)分泌，只有很少的外泌體駐留在注射區(qū)，這極大地限制了治療的效率[32]。最近的一項(xiàng)研究表明，含有某些治療因子的神經(jīng)元定向納米顆粒直接穿透血腦屏障治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病[33]，因此，這種納米顆粒技術(shù)可以有望提供解決上述問(wèn)題的替代方法。

外泌體半衰期長(zhǎng)，廣泛分布于多種體液中，因此，可以以非侵入的方式收集和識(shí)別它們的成分。目前，外泌體作為一種血清標(biāo)志物，已被廣泛應(yīng)用于前列腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌等多種腫瘤的診斷。雖然不可能通過(guò)鑒定單個(gè)生物標(biāo)記物來(lái)診斷CVD，但是循環(huán)血液中mi RNA含量的變化可以為CVD的早期檢測(cè)和干預(yù)提供新的途徑。與干細(xì)胞不同的是，外泌體可以裝載特定的藥物，為基因治療提供了更直接有效的途徑。因此，體外操縱供體細(xì)胞，提高外泌體的作用效果，可能是今后治療多種疾病的一種有效途徑。