乙型肝炎病毒對(duì)肝癌細(xì)胞中Notch信號(hào)通路的影響

劉利平，張悅，劉林森，郭躍華，張育森，鮑世韻

(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院，深圳 518020)

腫瘤干細(xì)胞的增殖和干性維持與Notch、Wnt、Hedgehog等信號(hào)通路密切相關(guān)[1,2]。Notch信號(hào)通路由Notch受體、Notch配體和細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器分子組成[3～5]。研究顯示Notch1、Notch2、Notch3、Notch4在肝癌組織中常呈過(guò)表達(dá)狀態(tài)，乙肝病毒X蛋白(HBx)可上調(diào)Notch1、Notch3、Notch4表達(dá)[6～8]。HBx是乙型肝炎病毒(HBV)編碼的蛋白產(chǎn)物之一。HBV是肝癌的重要致病因素之一，其對(duì)Notch信號(hào)表達(dá)的影響目前少見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。2016年5月～2017年3月，我們探討了HBV對(duì)肝癌細(xì)胞中Notch信號(hào)通路的影響。

1　 材料與方法

1.1材料收集2012～2013年暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院病理科診斷為慢性肝炎組織標(biāo)本10例份，其中患者男8例、女2例，年齡(56.87±9.13)歲。10例患者乙肝表面抗原均為陽(yáng)性。同時(shí)收集血管瘤瘤旁(距血管瘤2 cm)組織10例份，其中患者男7例、女3例，年齡(46.53±12.69)歲。10例患者乙肝表面抗原和丙肝抗體均為陰性。檢測(cè)標(biāo)本均通過(guò)病理組織學(xué)檢查確診。鼠抗人Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Hes1、Hey1單克隆抗體均購(gòu)自Santa Cruz 公司。胎牛血清、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)LifeTechnologies公司。PCR引物購(gòu)于Invitrogen公司。肝癌HepG2.2.15細(xì)胞由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院盧銀平教授饋贈(zèng)。HepG2細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。

1.2肝癌細(xì)胞中Notch通路相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)采用Real-time PCR法。將處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)階段的HepG2細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞種于6孔板中，待細(xì)胞80%融合時(shí)，收獲上述2種細(xì)胞，提取總RNA，測(cè)定RNA的濃度和純度。取0.5 μg的mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，10倍稀釋后用于PCR檢測(cè)。Notch1引物序列：正向引物：5′-GTCAACGCCGTAGATGACC-3′，反向引物：5′-TTGTTAGCCCCGTTCTTCAG-3′；Notch2引物序列：正向引物：5′-ACTGTGAGGAGCAACTCGAT-3′，反向引物：5′-TCCACTTCATACTCACAGTTGA-3′；Notch3引物序列：正向引物：5′-TGACCGTACTGGCGAGACT-3′，反向引物：5′-CCGCTTGGCTGCATCAGCA-3′；Notch4引物序列：正向引物：5′-AACTCCTCCCCAGGAATCTG-3′，反向引物：5′-CCTCCATCCAGCAGAGGTT-3′；Hes1引物序列：正向引物：5′-ACACGACACCGGATAAACCA-3′，反向引物：5′-GCCGCGAGCTATCTTTCTTC-3′;Hey1引物序列：正向引物：5′-ATCTGCTAAGCTAGAAAAAGCC-3′，反向引物：5′-CGTCAAAGTAACCTTTCCCTCC-3′。總反應(yīng)體積為10 μL：sybrGreen Mix 5 μL，cDNA模板1 μL，正向引物(10 μmol/L)0.5 μL，反向引物(10 μmol/L)0.5 μL，去離子水3 μL。反應(yīng)條件：95 ℃變性1 min，40次循環(huán)內(nèi)95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，最后72 ℃延伸7 min。基因表達(dá)采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.3肝癌細(xì)胞中Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)采用Western blotting法。分別收獲HepG2細(xì)胞和HepG2.2.15細(xì)胞，通過(guò)三去污裂解液提取總蛋白，定量后經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。加入鼠抗人Notch1、Notch2、Notch3、Notch4單克隆抗體1∶500稀釋；鼠抗人Hes1和Hey1單克隆抗體1∶1 000稀釋；鼠抗人β-actin單克隆抗體1∶2 000稀釋。加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗，1∶1 000稀釋?；瘜W(xué)發(fā)光法曝光顯色。通過(guò)計(jì)算機(jī)掃描蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行灰度分析。以β-actin作為內(nèi)參照,分別用Notch1～4/β-actin、Hes1/β-actin、Hey1/β-actin值代表Notch1～4、Hes1、Hey1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4乙型慢性肝炎組織和血管瘤瘤旁正常肝組織中Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)采用免疫組化S-ABC法染色，檢測(cè)Notch1、Notch2、Notch3、Notch4蛋白在乙型慢性肝炎組織和血管瘤瘤旁正常肝組織中的表達(dá)。Notch1、Notch2、Notch3、Notch4蛋白陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)淺黃、棕黃或棕褐色顆粒[8]。

2　 結(jié)果

2.1肝癌細(xì)胞中Notch通路相關(guān)基因及蛋白表達(dá)比較 HepG2.2.15細(xì)胞、HepG2細(xì)胞中Notch1基因相對(duì)表達(dá)量分別為1.31±0.04、1.00±0.01，Notch2基因相對(duì)表達(dá)量分別為1.39±0.03、0.99±0.01，Notch3基因相對(duì)表達(dá)量分別為1.23±0.02、1.00±0.01，Notch4基因相對(duì)表達(dá)量分別為1.26±0.01、1.00±0.01，下游靶基因Hes1基因相對(duì)表達(dá)量分別為2.23±0.04、0.99±0.01，Hey1基因相對(duì)表達(dá)量分別為1.95±0.07、1.00±0.01，兩種肝癌細(xì)胞中Notch通路相關(guān)基因表達(dá)比較，P均<0.05。HepG2.2.15細(xì)胞、HepG2細(xì)胞中Notch1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.71±0.12、0.99±0.07，Notch2蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.68±0.09、0.97±0.05，Notch3蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.57±0.08、0.96±0.04，Notch4蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.53±0.09、0.96±0.07，下游靶基因Hes1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為3.19±0.11、0.97±0.06，Hey1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為2.42±0.13、0.98±0.07，兩種肝癌細(xì)胞中Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較，P均<0.05。

2.2乙型慢性肝炎組織和血管瘤瘤旁正常肝組織中Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較Notch1、Notch2、Notch3、Notch4在肝炎組織中呈彌漫表達(dá)，陽(yáng)性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)。Notch1、Notch2、Notch3、Notch4蛋白在肝炎組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為90%、70%、90%、80%，在血管瘤瘤旁組織中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為20%、20%、10%、10%，乙型慢性肝炎組織和血管瘤瘤旁正常肝組織中Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較，P均<0.05。

3　討論

肝癌干細(xì)胞被認(rèn)為是肝癌發(fā)生、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的根源[6～8]。肝癌干細(xì)胞的增殖和干性維持與Notch通路的激活及表達(dá)增加密切相關(guān)。研究顯示，缺氧條件下缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α胞內(nèi)聚集并進(jìn)入核內(nèi)，與核內(nèi)的HIF-1β相結(jié)合形成有活性的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與靶基因啟動(dòng)子上的CGTG結(jié)合，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄[9]。Yang等[8]研究結(jié)果顯示，Notch1～4有可能是HIF-1α的下游靶基因。Gao等[10]研究報(bào)道HBx可上調(diào)Notch1和Notch4表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，HBV可同時(shí)上調(diào)Notch1～4基因及Notch通路下游的Hes1和Hey1表達(dá)，此可能是引起肝癌細(xì)胞Notch信號(hào)通路激活的原因之一。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，肝炎組織Notch通路亦呈激活狀態(tài)，表明Notch通路的激活先于肝癌的發(fā)生。

Notch通路激活后可誘導(dǎo)正常細(xì)胞致瘤性轉(zhuǎn)化，可促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝和葡萄糖攝取，可激活NF-κB和PI3K/AKT信號(hào)通路及抑制抑癌基因p53的表達(dá)，發(fā)揮抗凋亡作用。Notch信號(hào)通路激活后還可增強(qiáng)CDK2和CyclinD的活性，進(jìn)而加快細(xì)胞周期進(jìn)程[11,12]。研究[6～8]顯示，Notch1、Notch3、Notch4高表達(dá)的肝癌患者較易出現(xiàn)血管侵犯，術(shù)后較易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。阻斷Notch通路的激活可抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及侵襲轉(zhuǎn)移。

已有研究顯示抗HBV治療在預(yù)防肝癌發(fā)生及抑制肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移中能起到良好作用[13]。本研究結(jié)果顯示，HBV可激活同肝癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的Notch信號(hào)通路，此為肝炎及肝癌患者抗病毒治療提供了新的理論基礎(chǔ)。

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