雙磷酸鹽及其功能化藥物在骨轉移診斷和治療中的研究進展

林勤劍

廣東三九腦科醫(yī)院臨床藥學科（廣州510510）

骨轉移癌是一類廣泛研究的繼發(fā)性癌癥，轉移灶的存在大大降低了治愈的可能性并嚴重影響了癌癥患者的生活質量。骨組織特殊的微環(huán)境可支持腫瘤的存活和生長，有助于骨轉移的形成［1-2］，目前報道的轉移到骨的最常見原發(fā)性腫瘤包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、甲狀腺癌、腎癌、口腔癌及多發(fā)性骨髓瘤［3-4］，近75%的晚期乳腺癌或前列腺癌患者易發(fā)生骨轉移，降低了患者的生存率［5］。骨中腫瘤的發(fā)展是由腫瘤細胞和骨細胞（成骨細胞和破骨細胞）之間相互刺激、相互作用的結果。骨轉移也涉及其他類型的細胞如成纖維細胞和免疫細胞（巨噬細胞、自然殺傷細胞、T和B細胞），不同細胞復雜的相互作用會破壞由破骨細胞和成骨細胞介導的骨平衡［6］，最終引起溶骨反應或成骨細胞損傷導致骨形成減少。

骨轉移的形成機制與其他非骨骼器官的腫瘤轉移機制相似，即原發(fā)灶腫瘤細胞在蛋白水解酶輔助下逃避宿主監(jiān)測到達骨組織微環(huán)境，具有遷移能力的癌細胞同時侵入骨髓基質，并在內皮骨表面誘導自己的血液供應。隨后，癌細胞可根據(jù)腫瘤的性質刺激破骨細胞或成骨細胞的活性。在轉移性骨病變中，骨表面通常被破骨細胞和腫瘤細胞包圍，破骨細胞在腫瘤細胞存在時，由甲狀旁腺激素相關肽（PTHrP）和核因子κB配體的受體激活劑（RANKL）等激活而誘導骨吸收，刺激骨質溶解，并釋放促進腫瘤進展的TGF?β等生長因子，建立了促進腫瘤生長并加速骨骼破壞的惡性循環(huán)［7］?；诠寝D移的分子機制，目前破骨細胞抑制劑被提倡作為預防骨轉移的有力工具［8］。在骨轉移發(fā)展的新型療法中，基于雙磷酸鹽的治療頗具吸引力，這不僅得益于其作為抗骨吸收藥物長期臨床應用的優(yōu)勢，也與在抗腫瘤組合療法中所呈現(xiàn)的優(yōu)勢密切相關。

1 雙磷酸鹽的一般特征及作用機制

雙磷酸鹽是具有與中心碳原子結合的兩個磷酸酯基團（P?C?P）的無機焦磷酸鹽類似物，與焦磷酸鹽中水解不穩(wěn)定的P?O?P鍵相反，該P?C?P鍵對酶水解具有抗性。研究證實，雙磷酸鹽對羥基磷灰石的親和力高于其他鈣基礦物質，如草酸鹽、碳酸鹽或焦磷酸鹽等，因此可通過與骨組織細胞外基質中的礦物相（即羥基磷灰石）結合來抑制骨吸收，這種現(xiàn)象在骨轉換率較高時更為顯著。礦物相的高選擇性和體內相對低毒促進了雙磷酸鹽的臨床應用，一般來說，雙磷酸鹽根據(jù)其化學結構可分為無氮（非氨基-雙磷酸鹽）及含氮（氨基-雙磷酸鹽）兩類。目前臨床批準的非氨基二膦酸鹽主要包括氯膦酸鹽、替魯膦酸鹽和依替膦酸鹽，而氨基雙磷酸鹽包括伊班膦酸鹽、帕米膦酸鹽、阿侖膦酸鹽、利塞膦酸鹽和唑來膦酸鹽?；趯墙M織的強親和力，雙磷酸鹽是目前治療佩吉特病、骨質疏松癥、發(fā)育不良和成骨不全等慢性骨病的一線藥物［9?10］。不僅如此，臨床前研究和臨床試驗都證實，雙磷酸鹽可避免癌癥引起的骨質流失并防止癌癥患者骨轉移的發(fā)生［11］。

不同分子結構的雙磷酸鹽具有不同的作用機制和藥效，但都可通過破骨細胞介導的內吞而作用于成熟的破骨細胞，進而抑制骨吸收；或通過干擾腫瘤細胞和骨細胞之間的惡性循環(huán)來誘導骨轉移微環(huán)境中的破骨細胞凋亡，減輕骨轉移和骨破壞的程度。

近年來，雙磷酸鹽應用于骨轉移預防的輔助治療臨床效果得到了廣泛的認可［12］。其機制在于抑制破骨吸收間接抑制腫瘤生長或直接發(fā)揮抗腫瘤效應。此外，雙磷酸鹽可激活γδT細胞以引發(fā)宿主免疫應答，分泌促炎細胞因子并發(fā)揮對腫瘤的毒性作用［13］。雙磷酸鹽也可有效減少腫瘤微環(huán)境中腫瘤相關巨噬細胞（TAM），最終影響異種移植小鼠模型中的腫瘤生長［14］，或逆轉腫瘤環(huán)境中TAM的亞型，即由M2型逆轉為殺死腫瘤細胞的M1型。

2 雙磷酸鹽功能化藥物及載體的研究和應用現(xiàn)狀

雙磷酸鹽目前仍被主要用作抗骨質疏松藥物，然而，長期、高劑量、廣泛的雙磷酸鹽給藥引發(fā)的不良反應仍不容忽視，如下頜骨壞死、非典型股骨骨折、胃腸道副作用及腎功能損害等。雙磷酸鹽對礦物質的高度親和性為其與顯像劑、抗腫瘤藥物及納米載體或其他生物醫(yī)用材料偶聯(lián)并靶向骨組織提供了可能。在過去的幾十年，雙磷酸鹽功能化的診斷和治療策略不斷發(fā)展，保證了其體內應用穩(wěn)定性的同時，仍保持雙磷酸鹽的功能化。

2.1 雙磷酸鹽功能化顯像劑 熒光素可用于在體外內標記腫瘤細胞或腫瘤組織，而用于腫瘤的臨床前期研究［15］。熒光素可通過氨基與雙磷酸鹽偶聯(lián)，如利塞膦酸鹽的吡啶基與熒光素通過形成環(huán)氧化物而穩(wěn)定偶聯(lián)。雙磷酸鹽功能化顯像劑的臨床前研究已有大量報道，BHUSHAN等報道了通過酰胺鍵將近紅外（NIR）熒光體與帕米膦酸鹽偶聯(lián)，與其他鈣鹽相比，其與羥基磷灰石的親和性提高8倍，可為骨轉移鈣化灶的早期檢測提供可能。遠紅外熒光體通過酰胺鍵與帕米膦酸鹽偶聯(lián)后，可實現(xiàn)雙磷酸鹽體內代謝、與細胞相互作用及特異性累積的實時檢測。該類雙磷酸鹽功能化的熒光分子探針均可通過光學成像定量評估骨腫瘤模型中腫瘤體積的變化、骨腫瘤的礦化及骨轉移程度等［16］，且在臨床前的豬、Balb/c小鼠、裸鼠和NCR小鼠等動物模型中均有研究［17-18］。

另一類顯像劑，放射性示蹤物也可通過螯合作用與雙磷酸鹽偶聯(lián)，包括 Tc?99m、Sr?89、Re?186/188、Ga?67/68、In?111、Lu?177、Ho?166和Ra?223 等，偶聯(lián)后的探針可作為骨靶向的示蹤劑，采用PET?CT等手段用于骨轉移等骨病的診斷和治療［19］。也有文獻證明，基于對羥基磷灰石的親和性，雙磷酸鹽可通過與金納米顆粒偶聯(lián)，實現(xiàn)對鈣化灶X射線檢查的敏感性，并可提高X射線的衰減系數(shù)［20］。

2.2 雙磷酸鹽功能化的抗腫瘤藥物 雙磷酸鹽可通過酯鍵或氨基甲酸酯鍵與目前常規(guī)應用的抗腫瘤藥物偶聯(lián)，如甲氨蝶呤，苯乙酸和核苷類似物［2′-脫氧-5-氟尿嘧啶（5?FdU），1?β?D?阿糖呋喃脲嘧啶和疊氮胸苷］等，形成在生理條件下可穩(wěn)定到達骨轉移部位的復合物。臨床前研究結果顯示，基于雙磷酸鹽的骨靶向性，雙磷酸鹽與甲氨蝶呤偶聯(lián)后，其對骨肉瘤的抑制效率比單獨使用甲氨蝶呤提高了5倍。雙磷酸鹽功能化的抗腫瘤藥物另一個重要的優(yōu)點即化療藥物全身毒性的降低，如5?FdU與氨羥二磷酸二鈉或阿倫磷酸鈉偶聯(lián)后，可用于骨轉移癌的治療，且全身細胞毒性顯著降低［21］。除傳統(tǒng)的化療藥物外，最近的研究表明，雙磷酸鹽也可靶向攜帶抗腫瘤小分子抑制劑BET bromodomain，如JQ1至骨腫瘤發(fā)生部位，而發(fā)揮靶向殺滅腫瘤細胞的效果［22］。

2.3 雙磷酸鹽功能化的納米載體 藥物與納米載體的共價偶聯(lián)可借助納米材料體內循環(huán)時間長、實體瘤的高通透性和滯留效應（enhanced permeability and retention，EPR）、不可穿過血腦屏障以避免抗神經毒性等優(yōu)點以增加的腫瘤定位，促進體內治療效果的增強。雙磷酸鹽功能化納米顆粒的臨床前研究在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌等骨轉移癌和骨肉瘤、多發(fā)骨髓瘤等骨腫瘤中有較多研究，動物模型多為Balb/c裸鼠、SCID鼠和Swiss鼠［23-25］。如將阿倫磷酸鈉與載藥PLGA納米顆粒偶聯(lián)，評估其治療裸鼠骨轉移癌的效果可見，阿倫磷酸鈉發(fā)揮的骨靶向作用，可大幅提高偶聯(lián)物的治療效果［26］。THAMAKE等開發(fā)了表面包被阿侖膦酸鹽的PLGA藥物遞送納米顆粒系統(tǒng)，內部包封姜黃素（化學治療劑，抑制RANKL誘導的骨吸收）和硼替佐米（蛋白酶體抑制劑）后，在骨轉移模型中表現(xiàn)出阻止骨吸收并降低腫瘤生長速率的優(yōu)勢［27］。SWAMI等［28］也合成了包被阿侖膦酸鹽的PLGA載藥（硼替佐米）納米粒子，進一步于表面PEG化，以增加載藥納米顆粒在體內的循環(huán)時間，對多發(fā)骨髓瘤等的治療效果顯著。與此同時，腫瘤微環(huán)境的特點為雙磷酸鹽功能化納米載體的發(fā)展提供了可能，在藥物與納米顆粒之間引入酶解接頭，可被腫瘤周圍高表達的蛋白水解酶水解，增加藥物主動靶向的效果。如有研究將阿侖膦酸鈉和紫杉醇均通過四肽 Gly?Phe?Leu?Gly（GFLG?ONp）與N?（2?羥丙基）甲基丙烯酰胺（HPMA）共聚物偶聯(lián)，腫瘤細胞中過表達的溶酶體酶cathepsin B可特異性識別GFLG接頭，實現(xiàn)藥物的靶向遞送，結果表明聯(lián)合治療對腫瘤的骨轉移癌抑制率較單獨使用阿侖膦酸鹽或紫杉醇提高了60%。

除了傳統(tǒng)的納米載體外，雙磷酸鹽也可與脂質體偶聯(lián)，目前只有兩種類型的雙磷酸鹽功能化藥物（99mTc?羥基亞甲基二膦酸鹽和99mTc?亞甲基二膦酸鹽）已被批準用于惡性骨腫瘤的臨床檢測和治療。唑來膦酸功能化的脂質體也有大量的臨床前研究，如包封脂質體形成LipoZol，相對于單獨使用的唑來膦酸，Lipzol對前列腺癌（PC3）和多發(fā)性骨髓瘤（OPM2）的抑制率提高了42%～46%，且可抑制腫瘤血管生成，降低腫瘤血管密度［29，32］。

雙磷酸鹽還可通過與其他類型的納米顆粒，如磷酸鈣納米顆粒自組裝形成PLCaPZ復合物，表面輔以PEG修飾，抑瘤率高于68%。

2.4 雙磷酸鹽功能化的生物材料 雙磷酸鹽功能化的生物材料應用于骨轉移治療近年來也多有報道，除傳統(tǒng)的鈣磷基材料外，雙磷酸鹽也可與其他類型的生物材料偶聯(lián)，如與水凝膠類材料偶聯(lián)，并負載生長因子，形成類細胞外基質成分，抑制骨轉移病灶部位的骨吸收作用［33］；與透明質酸偶聯(lián)，通過特異性作用于破骨細胞表面的CD44受體而發(fā)揮溶骨抑制效應［34］；或與高分子聚合物偶聯(lián)，形成生物安全且可降解的可注射支架材料［35］；也可與生物玻璃類材料偶聯(lián)，應用于骨腫瘤或骨轉移癌治療后的骨組織工程中［36］。

3 結論與展望

基于雙磷酸鹽對骨轉移區(qū)域中高代謝區(qū)或病理性鈣化區(qū)的選擇性親和力，可作為一類理想的骨靶向劑。本文前述了雙磷酸鹽及其功能化藥物、載體在骨腫瘤和骨轉移癌的診斷和靶向治療中的研究進展。包括雙磷酸鹽可與熒光探針或放射性示蹤劑結合成像，如雙磷酸鹽與熒光顯影劑、放射性核素如γ射線（用于SPECT成像）、正電子發(fā)射體（用于PET成像）和磁共振造影劑等結合用于骨靶向成像等，以檢測與骨轉移以及骨骼外腫瘤相關的微鈣化灶；或與抗腫瘤藥物、納米載體或生物材料偶聯(lián)靶向治療骨腫瘤，如與一系列抗腫瘤化合物、小分子抑制劑或納米載體（脂質體或聚合物納米顆粒）偶聯(lián)，通過靶向遞送藥物或納米載體的EPR效應，增加腫瘤部位藥物濃度，提高藥物的治療效果，并降低全身毒性，因此具有應用于骨腫瘤或骨轉移癌骨組織工程中的潛力。

目前，雙磷酸鹽已在臨床應用于骨質疏松等骨病的治療，延緩骨骼病變的發(fā)生和進展。然而，雙磷酸鹽的廣泛或全身應用的副作用仍較多，為推進雙磷酸鹽應用于骨轉移癌的治療或雙磷酸鹽功能化藥物/載體的臨床應用，臨床前研究應采用更接近臨床的腫瘤模型，如患者來源的異種移植（PDX）模型，或人源細胞系建立原位骨腫瘤模型和骨轉移模型等。從醫(yī)用材料發(fā)展的角度，骨靶向的雙磷酸鹽功能化納米載體的體內分布模式也需進行更深入的研究，納米載體的大小、電荷、分子量、偶聯(lián)方式和體內作用機制等應詳細說明，以實現(xiàn)最高劑量的藥物遞送和最佳的治療效果，推進雙磷酸鹽聯(lián)合用藥的臨床推廣應用。

參考文獻

［1］SOTTNIK J K，DAI J，ZHANG H，et al.Tumor?induced pres?sure in the bone microenvironment causes osteocytes to promote the growth of prostate cancer bone metastases［J］.Cancer Res，2015，75（11）：2151?2158.

［2］FUTAKUCHI M，F(xiàn)UKAMACHI K，SUZUI M.Heterogeneity of tumor cells in the bone microenvironment：Mechanisms and therapeutic targets for bone metastasis of prostate or breast can?cer［J］.Adv Drug Deliv Rev，2016，99（Pt B）：206?211.

［3］KELLESARIAN S V，SUBHI ALHARTHI S，SALEH BIN?SHABAIB M，et al.Effect of local zoledronate delivery on os?seointegration：a systematic review of preclinical studies［J］.Acta Odontol Scand，2017，75（7）：530-541.

［4］馬文娟，鄒君惠，楊智堅，等.骨組織修復及再生研究進展［J］.實用醫(yī)學雜志，2016，32（1）：151?153.

［5］FABIAN K，PUSKAS R，KAKUK T，et al.Renal impairment hampers bisphosphonate treatment in a quarter of lung cancer patients with bone metastasis［J］.Basic Clin Pharmacol Toxi?col，2017，doi：10.1111/bcpt.12854.

［6］CRISCITIELLO C，VIALE G，GELAO L，et al.Crosstalk be?tween bone niche and immune system：osteoimmunology signal?ing as a potential target for cancer treatment［J］.Cancer Treat?ment Reviews，2015，41（2）：61?68.

［7］符策崗，趙紅衛(wèi)，劉揚，等.骨肉瘤繼發(fā)性化療耐藥機制的研究進展［J］.實用醫(yī)學雜志，2015，31（14）：2387?2388.

［8］VINAY R，KUSUMDEVI V.Potential of targeted drug delivery system for the treatment of bone metastasis［J］.Drug Deliv，2016，23（1）：21?29.

［9］COLE L E，VARGO?GOGOLA T，ROEDER R K.Targeted de?livery to bone and mineral deposits using bisphosphonate li?gands［J］.Adv Drug Deliv Rev，2016，99（Pt A）：12?27.

［10］ REYES C，HITZ M，PRIETO?ALHAMBRA D，et al.Risks and benefits of bisphosphonate therapies［J］.J Cell Biochem，2015，117（1）：20?28.

［11］ SANTINI D，STUMBO L，SPOTO C，et al.Bisphosphonates as anticancer agents in early breast cancer：preclinical and clini?cal evidence［J］.Breast Cancer Res，2015，17（1）：121.

［12］ PAPAMERKOURIOU Y M，KENANIDIS E，GAMIE Z，et al.Treatment of multiple myeloma bone disease：experimental and clinical data［J］.Expert Opin Biol Ther，2015，15（2）：213?230.

［13］ VAN ACKER H H，ANGUILLE S，WILLEMEN Y，et al.Bisphosphonates for cancer treatment：mechanisms of action and lessons from clinical trials［J］.Pharmacol Ther，2016，158（1）：24?40.

［14］ XIA L，HUANG W，TIAN D，et al.Forkhead box Q1 pro?motes hepatocellular carcinoma metastasis by transactivating ZEB2 and VersicanV1 expression［J］.Hepatology，2014，59（3）：958?973.

［15］ 楊曉峰，趙揚，賈新友，等.腫瘤導向肽介導熒光分子探針診斷膀胱腫瘤的臨床前期研究［J］.中華泌尿外科雜志，2015，36（6）：463?467.

［16］ 趙峰，王瑩，趙倩，等.～（99）Tc～m?MDP核素骨顯像骨外軟組織異常攝取骨顯像劑的臨床意義［J］.實用醫(yī)學雜志，2010，26（5）：821?822.

［17］ NAKAYAMA H，KAWASE T，OKUDA K，et al.In?vivo near?in?frared optical imaging of growing osteosarcoma cell lesions xeno?grafted in mice：dual?channel quantitative evaluation of volume and mineralization［J］.Acta Radiol，2011，52（9）：978?988.

［18］ BAO K，NASR K A，HYUN H，et al.Charge and hydrophobici?ty effects of NIR fluorophores on bone?specific imaging［J］.Theranostics，2015，5（6）：609?617.

［19］ PFANNKUCHEN N，MECKEL M，BERGMANN R，et al.Nov?el radiolabeled bisphosphonates for PET diagnosis and endora?diotherapy of bone metastases［J］.Pharmaceuticals（Basel），2017，10（2）：E45.

［20］ COLE L E，VARGO?GOGOLA T，ROEDER R K.Bisphospho?nate?functionalized gold nanoparticles for contrast?enhanced X?ray detection of breast microcalcifications［J］.Biomaterials，2014，35（7）：2312?2321.

［21］ SCHOTT S，VALLET S，TOWER R J，et al.In vitro and in vi?vo toxicity of 5?FdU?alendronate，a novel cytotoxic bone?seek?ing duplex drug against bone metastasis ［J］.Invest New Drugs，2015，33（4）：816?826.

［22］ WU V M，MICKENS J，USKOKOVIC V.Bisphosphonate?func?tionalized hydroxyapatite nanoparticles for the delivery of the bromodomain inhibitor JQ1 in the treatment of osteosarcoma［J］.ACS Appl Mater Interfaces，2017，9（31）：25887?25904.

［23］ MIKKER K，CLEMENTI C，POLYAK D，et al.Poly（ethylene glycol）?paclitaxel?alendronate self?assembled micelles for the targeted treatment of breast cancer bone metastases［J］.Bioma?terials，2013，34（15）：3795?3806.

［24］ MORTON S W，SHAH N J，QUADIR M A，et al.Osteotropic therapy via targeted layer?by?layer nanoparticles［J］.Adv Healthc Mater，2014，3（6）：867?875.

［25］ RAMANLAL C K，KUMAR A，MEGRAJKHANDELWAL V K，et al.Bone metastasis targeting：a novel approach to reach bone using Zoledronate anchored PLGA nanoparticle as carrier system loaded with Docetaxel［J］.J Control Release，2012，158（3）：470?478.

［26］ DUNCAN R，VICENT M J.Polymer therapeutics?prospects for 21st century：the end of the beginning［J］.Adv Drug Deliv Rev，2013，65（1）：60?70.

［27］ RAICHUR V，VEMULA K D，BHADRI N，et al.Zolendronic acid?conjugated PLGA ultrasmall nanoparticle loaded with meth?otrexate as a supercarrier for bone?targeted drug delivery［J］.AAPS Pharm Sci Tech，2017，18（6）：2227?2239.

［28］ SWAMI A，REAGAN M R，BASTO P，et al.Engineered nano?medicine for myeloma and bone microenvironment targeting［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2014，111（28）：10287?10292.

［29］ HODGINS N O，WANG J T，AL?JAMAL K T.Nano?technolo?gy based carriers for nitrogen?containing bisphosphonates deliv?ery as sensitisers of γδ T cells for anticancer immunotherapy［J］.Adv Drug Deliv Rev， 2017， doi： 10.1016/j.ad?dr.2017.07.003.

［30］ GUTMAN D，EPSTEIN ?BARASH H，TSURIEL M，et al.Alendronate liposomes for antitumor therapy：activation of γδ T cells and inhibition of tumor growth［J］.Adv Exp Med Biol，2012，733：165?179.

［31］ WU D，WAN M.Methylene diphosphonate?conjugated adriamy?cin liposomes：preparation，characteristics，and targeted thera?py for osteosarcomas in vitro and in vivo［J］.Biomed Microde?vices，2012，14（3）：497?510.

［32］ HATTORI Y，YAMASHITA J，SAKAIDA C，et al.Evaluation of antitumor effect of zoledronic acid entrapped in folate?linked liposome for targeting to tumor?associated macrophages［J］.J Liposome Res，2015，25（2）：131?140.

［33］ KOOTALA S，ZHANG Y，GHALIB S，et al.Control of growth factor binding and release in bisphosphonate functionalized hy?drogels guides rapid differentiation of precursor cells in vitro［J］.Biomater Sci，2016，4（2）：250?254.

［34］ KOOTALA S，OSSIPOV D，VAN DEN BEUCKEN J J，et al.Correction：Bisphosphonate?functionalized hyaluronic acid showing selective affinity for osteoclasts as a potential treatment for osteoporosis［J］.Biomater Sci，2015，3（8）：1197?1207.

［35］ GUVEN M N，SECKIN ALTUNCU M，DEMIR DUMAN F，et al.Bisphosphonate?functionalized poly（β ?amino ester）net?work polymers［J］.J Biomed Mater Res A，2017，105（5）：1412?1421.

［36］ DIBA M，AN J，SCHMIDT S，et al.Exploiting bisphosphonate?bioactive?glass interactions for the development of self?healing and bioactive composite hydrogels［J］.Macromol Rapid Com?mun，2016，37（23）：1952?1959.