黃連解毒湯對膿毒癥模型小鼠肺損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究

李 翀 翁書和 梁莉萍 宋 斐 吳思慧

（1.三亞市人民醫(yī)院，海南三亞572000； 2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510405；3.廣東藥學(xué)院第一附屬醫(yī)院，廣東廣州510304）

膿毒癥（sepsis）表現(xiàn)為因感染引起宿主反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙，全球每年有數(shù)百萬人罹患膿毒癥，其中1/4甚至更多的患者死亡[1]。本病發(fā)病機(jī)制尚不能完全闡明，TLR4是其發(fā)病機(jī)制中可能的啟動(dòng)因子，并通過NF-κB等一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路級聯(lián)放大效應(yīng)，導(dǎo)致炎癥因子“瀑布樣爆發(fā)”[2]。中醫(yī)認(rèn)為感染屬于毒熱證范疇，病機(jī)屬“熱毒熾盛”，而膿毒癥各個(gè)時(shí)期都可存在嚴(yán)重感染，使用清熱解毒法解決“毒邪”這一主要矛盾，必可取得良好療效[3]。本課題組前期采用黃連解毒湯作為基本方，發(fā)現(xiàn)加味黃連解毒湯能降低實(shí)熱證多器官功能障礙綜合征（MODS）患者器官衰竭的發(fā)生率和病死率[4]，但黃連解毒湯治療MODS的機(jī)理尚不明確。本研究觀察了黃連解毒湯對膿毒癥模型小鼠血清及肺組織炎癥因子表達(dá)、TLR4轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響，探究其對膿毒癥小鼠肺損傷保護(hù)作用的機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 SPF級ICR小鼠100只，雌雄各半，體重（20±1.2）g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號：SCXK（粵）2011-0092。

1.2 藥物與試劑 黃連解毒湯水煎劑由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心制備，藥物組成：黃連10g、黃芩10g、黃柏10g、梔子10g（成人日服劑量），將藥物濃縮成50%、100%、200%藥液（相當(dāng)于生藥量0.13、0.27、0.53g/mL）各150mL并滅菌保存。酵母多糖A（Zymosan A）凍干粉，Sigma公司；白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）測試盒，上海酶聯(lián)生物科技；RT-PCR引物、實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR引物，上海英俊生物技術(shù)有限公司；RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR試劑盒及相關(guān)溶液，Roche公司。

1.3 儀器 2400型PCR儀，Perkin Elmer公司；7300型實(shí)時(shí)定量PCR儀，ABI公司；5810R型超低溫高速離心機(jī)，Eppendorf公司；酶聯(lián)分析儀，Tecan Genio公司；BH-2顯微鏡，日本奧林巴斯公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組、造模與給藥 將100只小鼠按分層隨機(jī)抽樣法分為正常組、模型組和黃連解毒湯高、中、低劑量組，每組20只，每組又分為造模后24h和48h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測組，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測10只。按照胡森等[5-6]方法制作小鼠膿毒癥模型：把4g酵母多糖A與50mL滅菌石蠟油混合，高頻振蕩30min，超聲振蕩6h，制成造模用混懸液，無菌條件下，模型組每只動(dòng)物予腹腔注射1mg/kg劑量酵母多糖-石蠟混懸液，建立膿毒癥小鼠模型。造模后動(dòng)物出現(xiàn)呼吸急促、寒戰(zhàn)、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、進(jìn)食進(jìn)水減少、排尿減少等膿毒癥表現(xiàn)，提示造模成功。造模同日開始灌胃給藥。給藥劑量采用體表面積換算，中劑量組給藥劑量等效于成人（70kg計(jì)），即每日給予小鼠0.2mL/10g灌胃，低、中、高劑量組分別給予50%、100%、200%藥液，正常組和模型組給予等體積生理鹽水，1次/d，持續(xù)至實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。

2.2 動(dòng)物行為學(xué)觀察 造模后分別于24h、48h觀察各組動(dòng)物一般狀況，如動(dòng)物毛發(fā)色澤、活動(dòng)能力、進(jìn)食及飲水情況、排便情況。

2.3 血清炎癥因子檢測 造模后24h、48h動(dòng)物眼眶采血留取血清樣本備檢，采用ELISA法檢測TNF-α、IL-6水平。

2.4 熒光定量PCR法檢測肺組織NF-κBp65、TLR4 mRNA表達(dá) 按Takara公司試劑盒說明書提取總RNA后，按Fermentas公司試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR，RT條件：42℃×60min，70℃×5min。轉(zhuǎn)錄后的cDNA按Takara公司試劑盒說明書進(jìn)行real-time PCR（25μL體系）。TLR4引物序列：Forward Primer 5’-ttggggaggaa gaaaggtctaac-3’，Reverse Primer 5’-tgctgactgaaataaggtgaaagc-3’；NF-κBp65引物序列：Forward Primer 5’-gaatctccctggtcaccaaagac-3’，Reverse Primer 5’-cagcctcatagaagccatccc-3’。real-time PCR反應(yīng)條件（兩步法）：Stage 1，預(yù)變性，Repeat 1，95℃30s；Stage 2，PCR反應(yīng)，Repeat 40，95℃5s，60℃31s；Dissociation Stage，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real Time PCR的擴(kuò)增曲線和溶解曲線。

2.5 肺組織病理觀察 造模后24h、48h取血后頸椎脫臼法處死小鼠，剪取肺組織置于4%甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟等處理，采用HE染色后于光鏡下觀察病理改變，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科完成。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，符合正態(tài)分布者采用 t 檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布者采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)血清炎癥因子水平比較（±s）

表1 各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)血清炎癥因子水平比較（±s）

注： 與正常組比較，**P＜0.01；與同時(shí)點(diǎn)模型組比較，##P＜0.01；與同時(shí)點(diǎn)低劑量組比較，△△P＜0.01；與本組24h比較，◆◆P＜0.01。

正常組24h1042.50±9.1041.08±9.13 48h1040.67±7.9639.81±8.83模型組24h10612.23±38.28**267.32±28.01**48h10757.11±38.47**◆◆321.60±37.76**◆◆黃連解毒湯低劑量組24h10550.25±51.92**##196.06±13.66**##48h10486.85±42.53**##◆◆146.79±16.40**##◆◆黃連解毒湯中劑量組24h10466.00±49.42**##△△161.24±23.92**##△△48h10205.33±54.09**##△△◆◆125.61±23.42**##△△◆◆黃連解毒湯高劑量組24h10441.74±56.40**##△△155.33±17.67**##△△48h10189.41±39.43**##△△◆◆116.88±19.90**##△△◆◆

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 小鼠行為學(xué)觀察 正常組小鼠呼吸均勻，毛色光亮，活動(dòng)靈敏，進(jìn)食飲水正常，大小便顏色和頻次正常。模型組小鼠在造模24h后普遍出現(xiàn)鼠毛臟濕、膚溫涼、眼瞼充血水腫、呼吸促、肢體顫抖、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍、進(jìn)食進(jìn)水減少、排便排尿減少的表現(xiàn)，48h時(shí)上述癥狀明顯加重。黃連解毒湯各劑量組小鼠在造模后也普遍出現(xiàn)鼠毛臟濕、活動(dòng)減少、進(jìn)食進(jìn)水減少的表現(xiàn)，但呼吸、活動(dòng)、進(jìn)食水及排便情況均明顯優(yōu)于模型組，尤其以中、高劑量組情況更佳，48h時(shí)上述癥狀明顯減輕。

3.2 各組小鼠血清炎癥因子水平比較 結(jié)果見表1。造模后，與正常組比較，模型組小鼠血清IL-6、TNF-α均明顯升高（P＜0.01），48h組較24h組有明顯增加（P＜0.01）。黃連解毒湯各劑量組小鼠血清IL-6、TNF-α水平雖仍顯著高于正常組（P＜0.01），但各時(shí)點(diǎn)均顯著低于模型組（P＜0.01），48h顯著低于24h（P＜0.01），以中、高劑量組效果更為明顯，中、高劑量組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3.3 各組小鼠肺組織NF-κBp65、TLR4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較 見表2。NF-κBp65、TLR4 mRNA在小鼠肺組織中均有表達(dá)。模型組各時(shí)點(diǎn)NF-κBp65、TLR4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于正常組（P＜0.01），其中48h時(shí)點(diǎn)表達(dá)量更高（P＜0.01）；黃連解毒湯中、高劑量組TLR4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯低于模型組（P＜0.01），黃連解毒湯各劑量組NF-κBp65 mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯低于模型組（P＜0.01）。黃連解毒湯中、高劑量組水平明顯低于低劑量組（P＜0.01），中、高劑量組組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。中、高劑量組48h水平明顯低于24h（P＜0.05，P＜0.01）。

3.4 各組小鼠肺組織病理變化 光鏡下觀察各組小鼠的肺組織病理變化見圖1。正常組小鼠肺組織未見損害。模型組肺泡隔明顯增寬，大部分肺泡萎陷，部分肺泡內(nèi)見較多紅細(xì)胞浸潤，細(xì)胞質(zhì)疏松、染色變淺，細(xì)胞核增大、染色變淺，48h時(shí)上述病理改變加重。黃連解毒湯各劑量組肺損害較模型組明顯減輕，僅見部分肺泡隔增寬和肺泡萎陷，肺泡內(nèi)見少量紅細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)疏松、染色正常，細(xì)胞核增大、染色正常，但48h時(shí)上述病理改變較24h仍有加重。

表2 各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)肺組織NF-κBp65、TLR4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較（±s）

表2 各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)肺組織NF-κBp65、TLR4 mRNA轉(zhuǎn)錄水平比較（±s）

注： 與正常組比較，**P＜0.01；與同時(shí)點(diǎn)模型組比較，##P＜0.01；與同時(shí)點(diǎn)低劑量組比較，△△P＜0.01；與本組24h比較，◆P＜0.05，◆◆P＜0.01。

正常組24h101.01±0.170.459±0.170 48h100.928±0.180.477±0.212模型組24h105.08±1.17**3.143±1.036**48h107.13±1.20**◆◆3.917±0.728**◆◆黃連解毒湯低劑量組24h104.25±0.90**##2.65±0.68**48h103.89±0.85**##2.22±0.74**##黃連解毒湯中劑量組24h102.48±0.61**##△△2.143±0.610**##△△48h101.83±0.52**##△△◆◆1.565±0.733**##△△◆黃連解毒湯高劑量組24h102.7±0.68**##△△1.994±0.618**##△△48h102.01±0.59**##△△◆◆1.508±0.718**##△△◆◆

圖1 各組小鼠肺組織病理變化（HE染色，×100）

4 討論

TLR樣受體（Toll-like receptors，TLRs）被認(rèn)為是生物體最重要的模式識別受體，其在天然免疫細(xì)胞的表達(dá)使機(jī)體能夠及時(shí)感知感染等危險(xiǎn)信號[7]。其中，TLR4可以識別不同的細(xì)菌或病毒產(chǎn)物，它識別革蘭陰性菌內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），通過MyD88依賴和非MyD88依賴兩種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路途徑誘導(dǎo)NF-κβ，使之移位進(jìn)入細(xì)胞核，啟動(dòng)炎癥因子如TNF-α和IL-6等的大量表達(dá)，最終導(dǎo)致肺等器官的損傷甚至多器官功能障礙綜合征[2，7-8]。

中醫(yī)理論認(rèn)為，“毒邪”是膿毒癥發(fā)生發(fā)展中必要的病理因素，熱毒煎熬血分，最后導(dǎo)致正虛邪實(shí)，氣滯血瘀，陰陽逆亂，衰而竭之[3，9]，因此清熱解毒法在膿毒癥治療中有著重要的地位。研究表明，清熱解毒代表方黃連解毒湯對銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌等多種細(xì)菌均有高效抑制作用，能對抗細(xì)菌毒素，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[10-12]；能阻斷LPS所誘導(dǎo)的TLR4高表達(dá)，從而抑制相關(guān)基因表達(dá)產(chǎn)物TNF-α、IFN-β過度分泌[13]；還可以延長膿毒癥大鼠的生存時(shí)間，減輕炎癥因子對器官的損傷，降低死亡率[14-15]。

本研究結(jié)果顯示，經(jīng)酵母多糖腹腔注射造模后，各組小鼠血清IL-6、TNF-α含量明顯升高，造模后48h更高于24h，這與人體發(fā)生膿毒癥后炎癥因子在體內(nèi)進(jìn)行性升高相符合。黃連解毒湯各劑量組較模型組同時(shí)間點(diǎn)血清IL-6、TNF-α水平均有明顯下降，以中、高劑量組作用尤其顯著。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與模型組各時(shí)段相比較，黃連解毒湯各劑量組肺組織NF-κBp65、TLR4 mRNA基因表達(dá)水平均有顯著降低，這一趨勢與血清炎癥因子的降低基本吻合。同時(shí)，病理結(jié)果顯示，黃連解毒湯能顯著保護(hù)小鼠肺組織結(jié)構(gòu)的完整性，減輕肺泡塌陷和細(xì)胞水腫。提示黃連解毒湯可能是通過調(diào)控TLR4、NF-κB的表達(dá)進(jìn)而抑制膿毒癥小鼠的炎癥反應(yīng)，減少炎癥因子的表達(dá)，以降低肺損傷的程度。中、高劑量效果更為顯著，但組間并無顯著性差異，證實(shí)了黃連解毒湯中劑量即可達(dá)到較好的療效，因此治療最佳劑量確定為中劑量即臨床常用劑量。下一步課題組擬探討黃連解毒湯對膿毒癥小鼠TLR4/NF-κβ信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上其他級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)物的影響。

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