芫荽水提物的體外抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶作用的研究

徐悅，張衛(wèi)明，馬世宏，聶韡，單承鶯*

(1.南京師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，南京 210097；2.南京野生植物綜合利用研究院，南京 210042)

芫荽(CoriandrumsativumL.)，又名香菜、胡荽等，傘形科芫荽屬，是一種1年生或2年生的草本植物。芫荽原產(chǎn)于歐洲地區(qū)，早于漢代引入我國(guó)，目前內(nèi)大部分省份地區(qū)均有種植，是人們熟知的餐桌上的調(diào)味蔬菜。芫荽中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，具有抗氧化、降血糖、抗焦慮等藥理作用，在臨床上也有一定的食療作用[1]。目前對(duì)芫荽提取物的活性研究的報(bào)道大多集中于極性溶劑提取物[2-5]，對(duì)其水提物的活性研究甚少，芫荽作為一種常見(jiàn)的可食用的香辛蔬菜，同時(shí)又是一種全株可入藥的藥用植物，關(guān)注并研究其水提物的活性同樣具有廣泛的應(yīng)用意義。本實(shí)驗(yàn)主要研究了芫荽成熟莖葉和籽實(shí)兩部分的水提物的抗氧化活性和抑制α-葡萄糖苷酶的作用效果，以期為更好地開(kāi)發(fā)利用芫荽植株提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

成熟期芫荽莖葉和芫荽籽：均采自江蘇省南京市高淳區(qū)，經(jīng)南京野生植物綜合利用研究院肖正春教授鑒定為傘形科芫荽屬(CoriandrumsativumL.)的莖葉和籽實(shí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器

1.2.1 試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；DPPH：購(gòu)自上海麥克林公司；α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖：購(gòu)自上海源葉科技有限公司；PNPG：購(gòu)自阿拉丁試劑(上海)有限公司；其余試劑：均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2.2 儀器

電子分析天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司；高速萬(wàn)能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；T6紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；Thermo Scientific Multiskan FC 酶標(biāo)儀 賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；臺(tái)式微量高速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮儀器廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州天瑞儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理和提取物制備

將芫荽籽置于烘箱中，105 ℃烘干，粉碎后過(guò)40目篩，備用。成熟芫荽莖葉洗凈，晾干，再于烘箱中105 ℃烘干，剪碎后備用。分別取適量芫荽籽和芫荽莖葉，加入蒸餾水，料液比均為1∶10，加熱至微沸，水提3 h，濾去殘?jiān)瑸V液減壓濃縮干燥制得水提物浸膏。

1.3.2 提取物總黃酮含量的測(cè)定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，參考文獻(xiàn)[6]的方法，以蘆丁的濃度C為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出回歸方程。

樣品測(cè)定：取適量水提物浸膏配制成1 mg/mL的水溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的方法測(cè)定其吸光值，由回歸方程計(jì)算該樣品液中總黃酮的含量C，并由此計(jì)算出芫荽籽和成熟莖葉中的總黃酮含量。

1.3.3 體外抗氧化活性的研究

1.3.3.1 提取物對(duì)羥自由基的清除作用

采用改良的Smirnoff水楊酸法，實(shí)驗(yàn)以抗壞血酸(VC)做對(duì)照，計(jì)算清除率。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

注：A1為加樣品/VC，含H2O2；A2為加樣品/VC，不加H2O2；A0為不加樣品/VC，加H2O2。

1.3.3.2 提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用

[2]，[7]方法，DPPH溶液濃度為75 μmol/L。實(shí)驗(yàn)以抗壞血酸(VC)做對(duì)照，計(jì)算清除率。

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

注：A1為加樣品/VC；A2為只加入樣品/Vc；A0為不加樣品。

1.3.3.3 提取物還原能力測(cè)定

參考文獻(xiàn)[8]的方法，測(cè)定兩種提取物的還原力，實(shí)驗(yàn)以抗壞血酸(VC)為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果以O(shè)D值的大小來(lái)表示還原能力。

1.3.4 體外降血糖活性的研究

1.3.4.1 抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究

參考文獻(xiàn)[9]，配制0.4 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液、0.01 mol/L PNPG溶液和0.1 mol/L碳酸鈉溶液，備用。在96孔板中依次加入20 μL樣品溶液和40 μL α-葡萄糖苷酶溶液，于37 ℃恒溫箱中放置10 min，然后加入30 μL PNPG底物溶液，37 ℃溫度下反應(yīng)20 min后，加入100 μL Na2CO3溶液終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。實(shí)驗(yàn)以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照，步驟同上，計(jì)算抑制率。

抑制率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100。

注：A1為加樣品；A2為加樣品，不加酶和底物；A0為不加樣品。

1.3.4.2 抑制α-葡萄糖苷酶動(dòng)力學(xué)研究

根據(jù)文獻(xiàn)[10]，設(shè)置一系列底物濃度1.25，2.5，5，10 mmol/L。加入同一濃度抑制劑，在不同底物濃度條件下測(cè)定葡萄糖苷酶的活力，然后改變抑制劑的濃度，得到一系列不同底物濃度條件下的酶活力，實(shí)驗(yàn)方法同1.3.4.1。根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法結(jié)果的特征分析，推斷提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取物總黃酮含量

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法1.3.2進(jìn)行測(cè)定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見(jiàn)圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

蘆丁濃度C和吸光值A(chǔ)的關(guān)系曲線的回歸方程為：A=7.9271C-0.0016，相關(guān)系數(shù)R2=0.9998。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和回歸方程可計(jì)算出：芫荽籽水提物芫荽籽中總黃酮含量為4.4 mg/g，成熟芫荽莖葉中總黃酮含量為27.4 mg/g。

2.2 體外抗氧化活性的研究

2.2.1 提取物對(duì)羥自由基的清除作用

羥自由基(·OH)是造成組織細(xì)胞損傷的重要活性氧之一。通過(guò)測(cè)定對(duì)羥自由基清除的作用可以體現(xiàn)出抗氧化活性能力。

圖2 兩種水提物對(duì)羥自由基的清除作用

由圖2可知，芫荽籽水提物和成熟芫荽莖葉水提物對(duì)羥自由基均有較好的清除作用，在2～10 mg/mL濃度范圍內(nèi)清除自由基的能力隨著提取物的濃度增加而逐漸提高，10 mg/mL后略有下降。芫荽籽水提物和成熟芫荽莖葉水提物均在濃度為10 mg/mL時(shí)對(duì)羥自由基有最大清除率，分別為61.89%和32.42%，分別相當(dāng)于0.13 mg/mL和0.07 mg/mL VC溶液的清除率，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，籽水提物對(duì)羥自由基的清除率明顯高于莖葉提取物(p<0.05)，但兩者均低于VC的清除能力。

2.2.2 提取物對(duì)DPPH自由基的清除作用

DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)植物提取物的抗氧化能力。

圖3 兩種水提物對(duì)DPPH自由基的清除作用

由圖3可知，兩種提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力均呈現(xiàn)出濃度依賴性，且莖葉提取物對(duì)DPPH的清除率高于籽提取物，兩種水提物對(duì)自由基的清除作用具有顯著差異(p<0.05)，其中芫荽籽提取液的EC50為2.75 mg/mL，莖葉提取液的EC50為1.83 mg/mL，均顯示出良好的清除作用，但均低于陽(yáng)性對(duì)照VC(EC50=0.044 mg/mL)。

2.2.3 提取物還原能力測(cè)定

還原能力的測(cè)定是以普魯士藍(lán)[Fe4( Fe(CN)6)3]生成量作為指標(biāo)，由波長(zhǎng)700 nm處吸光值變化反映還原力大小，吸光值愈高表示樣品的還原力愈強(qiáng)。

圖4 兩種水提物的還原能力

由圖4可知，與未添加抗氧化劑組相比，添加了提取物的實(shí)驗(yàn)組的吸光值均明顯升高(p<0.05)。在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)還原力大小均與兩種提取物的濃度呈現(xiàn)出濃度依賴性，且芫荽莖葉提取物的還原能力明顯高于籽提取物(p<0.05)，實(shí)驗(yàn)最大濃度1.2 mg/mL的芫荽籽水提物和莖葉提取物的還原能力分別相當(dāng)于38，49 μg/mL的VC溶液的還原力。

2.3 體外降血糖活性的研究

2.3.1 抑制α-葡萄糖苷酶活性的研究

α-葡萄糖苷酶是一種糖苷水解酶，具有抑制作用靶點(diǎn)，可被作用于調(diào)節(jié)體內(nèi)糖代謝水平，目前，例如阿卡波糖等α-葡萄糖苷酶抑制劑已經(jīng)成為一種成熟的治療糖尿病的藥物。

圖5 兩種水提物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

由圖5可知，芫荽籽水提物和芫荽莖葉水提物均對(duì)α-葡萄糖苷酶有抑制作用，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，抑制效果均會(huì)隨著濃度增高而增強(qiáng)，兩種提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用效果具有顯著差異(p<0.05)，成熟芫荽莖葉提取物的抑制效果優(yōu)于芫荽籽提取物的作用效果，兩者的EC50分別為4.6，6.8 mg/mL。陽(yáng)性藥物阿卡波糖的EC50為28.1 mg/mL，由此可見(jiàn)，芫荽提取物明顯表現(xiàn)出更高的抑制效果，具有作為潛在的α-葡萄糖苷酶抑制劑的開(kāi)發(fā)前景。

2.3.2 抑制α-葡萄糖苷酶動(dòng)力學(xué)研究

圖6 成熟芫荽莖葉水提物對(duì)α-葡萄糖苷酶作用的雙倒數(shù)動(dòng)力學(xué)曲線

圖7 芫荽籽水提物對(duì)α-葡萄糖苷酶作用的雙倒數(shù)動(dòng)力學(xué)曲線

由圖6和圖7可知，在兩種不同提取物抑制反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，加入不同濃度抑制劑后，三條作用曲線相交于x軸，即酶的米氏常數(shù)Km保持不變，由此可以推斷出，芫荽籽水提物和成熟芫荽莖葉水提物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用類(lèi)型均屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

3 討論

芫荽作為一種藥食兩用的香辛植物，一直受到國(guó)內(nèi)外科研人員的廣泛關(guān)注。已有文獻(xiàn)中對(duì)芫荽極性溶劑提取物研究的報(bào)道居多，例如陳志紅等用乙醇作為提取劑測(cè)定了新鮮芫荽植株總黃酮含量(8.493 mg/g)、清除羥自由基(IC50=122.331 mg/L)和O2-(IC50=71.535 mg/L)的能力；韓瀠儀等[11]研究發(fā)現(xiàn)芫荽乙醇提取物具有對(duì)DNA和蛋白質(zhì)兩種大分子氧化損傷的保護(hù)活性，最小保護(hù)質(zhì)量濃度分別是4.0，125.0 μg/mL；李鋒等[12]比較了芫荽籽不同溶劑粗提物的體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)95%乙醇提取物具有較好的清除H2O2和羥自由基的能力；Mojtaba等[13]評(píng)價(jià)了芫荽的體內(nèi)抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)乙醇提取物對(duì)大鼠神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。然而芫荽作為常見(jiàn)的蔬菜，有關(guān)其水相提取物的研究報(bào)道略少，因而本實(shí)驗(yàn)主要研究了芫荽水提物的生物活性，包括清除自由基能力和抑制α-葡萄糖苷酶的活性。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，成熟芫荽莖葉和芫荽籽中的總黃酮含量分別為27.4，4.4 mg/g，且兩種水提物在不同抗氧化體系中均具有良好的效果，雖然與極性溶劑提取物相比抗氧化能力較弱，但水提物制備方便、安全可食，依舊具有潛在的開(kāi)發(fā)為天然抗氧化劑的價(jià)值。

芫荽中不僅含有黃酮類(lèi)化合物，據(jù)報(bào)道還含有多種酚酸成分[14]，多酚類(lèi)化合物不僅具有良好的抗氧化效果，同時(shí)也具有降血糖的效果[15]。目前有關(guān)芫荽降血糖的報(bào)道以外文文獻(xiàn)較多[16,17]，國(guó)內(nèi)有關(guān)報(bào)道甚少。經(jīng)本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，芫荽籽水提物(EC50=4.6 mg/mL)和成熟莖葉水提物(EC50=6.8 mg/mL)在較低濃度條件下對(duì)α-葡萄糖苷酶就能表現(xiàn)出較好的抑制效果，比陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖作用效果更好，表現(xiàn)為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。目前上市應(yīng)用的α-葡萄糖苷酶抑制劑有三類(lèi)：阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇，雖然這類(lèi)抑制劑具有突出的降血糖效果，但是通常也會(huì)伴隨一定的胃腸道方面的副作用[18]，而天然α-葡萄糖苷酶抑制劑具有更安全、易獲取的優(yōu)勢(shì)，因而越來(lái)越多的研究人員嘗試從天然植物中篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑。例如，張鐘等[19]從荔枝中分離出多糖成分，發(fā)現(xiàn)在80 mg/mL條件下具有最佳抑制效果。高小平等[20]從24種中藥材中篩選α-葡萄糖苷酶抑制劑，發(fā)現(xiàn)大黃、山茱萸、赤芍、五倍子這4種提取物具有良好的抑制效果。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步更全面地研究芫荽提供了基礎(chǔ)，其水提物在天然抗氧化劑和天然α-葡萄糖苷酶抑制劑方面具有潛在的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。

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