UPLC-Q-TOFMSE技術(shù)結(jié)合UNIFI數(shù)據(jù)庫快速分析桑黃化學(xué)成分

趙天一，王振洲，張楠淇，宿曉云，劉金平，李平亞，王翠竹※

（1.吉林省蒲川生物醫(yī)藥有限公司，長春 130012；2.吉林大學(xué)藥學(xué)院，長春 130021）

桑黃（Phellinus igniarius）屬擔(dān)子菌亞門多孔菌目針層孔菌屬真菌，為我國傳統(tǒng)真菌類中藥，味甘、辛，用于治療血崩、血淋、帶下、閉經(jīng)、脾虛泄瀉、脫肛瀉血等[1]。研究表明，桑黃中包含多種結(jié)構(gòu)類型的化學(xué)成分，包括多糖、黃酮、三萜類、芳香酸、氨基酸等，其中多糖類成分是含量最多的成分[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)也表明，桑黃具有多種藥理學(xué)活性，包括抗癌、免疫調(diào)節(jié)、抗肥胖、抗氧化和抗炎等。目前，針對桑黃化學(xué)成分的研究，仍以傳統(tǒng)的提取、分離、純化為主，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，缺乏整體研究。而且，一直以來對桑黃多糖的藥理作用研究比較多，但是對桑黃子實(shí)體中小分子化合物的研究報(bào)道相對較少。因此，對桑黃進(jìn)行全成分鑒定及更加深入的化學(xué)成分和藥理作用研究有重要的理論和實(shí)際意義。

近年來，超高效液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（UPLC-Q-TOF-MSE）已經(jīng)成為天然藥物中活性成分快速分離和鑒定的有力手段。UNIFI是一個(gè)簡單、高效、全面的平臺，數(shù)據(jù)庫中包括目前在600多味中藥中已發(fā)現(xiàn)的6000多種化合物信息，能夠?qū)?shù)據(jù)采集、峰提取、分子式確定、數(shù)據(jù)庫檢索及報(bào)告生成相結(jié)合，對化學(xué)成分進(jìn)行快速、全面地定性分析。將UPLC-QTOF-MSE與UNIFI平臺相結(jié)合，已經(jīng)被應(yīng)用到傳統(tǒng)中藥及復(fù)方中化學(xué)成分的快速鑒定中[3～7]。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MSE結(jié)合UNIFI平臺，對桑黃的化學(xué)成分進(jìn)行快速、全面地篩查分析，可為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)闡明、全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

XevoG2-XSQTOF四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀、ACQUITY超高效液相色譜二元泵和樣品管理器、Masslynx V4.1工作站、UNIFI1.7.0科學(xué)信息學(xué)系統(tǒng)（美國Waters公司）；N-A35型氮?dú)獍l(fā)生器（上海金浪科技有限公司）；FA1104N型電子天平（上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）；R201D型恒溫水浴鍋、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司）；TGL-16aR型飛鴿超離速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

UPLC-MS級乙腈（美國Fisher公司）；甲酸鈉、亮氨酸-腦啡肽（美國Sigma公司）；質(zhì)譜用水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）。

桑黃由吉林省蒲川生物醫(yī)藥有限公司提供，經(jīng)吉林大學(xué)藥學(xué)院李平亞教授鑒定為桑黃（P.igniarius）。

1.2 樣品溶液的制備

將干燥的桑黃子實(shí)體粉碎，研磨，過40目篩。取1g桑黃粉末，用70%甲醇在80℃水浴中提取3次，每次3h。過濾后，將濾液合并，旋干。用1.0mL 80%甲醇將提取物溶解，0.22μm濾膜過濾，取濾液備用。

1.3 UPLC-QTOF檢測條件

1.3.1 色譜條件 ACQUITYUPLCBEHC18色譜柱（100mm 2.1mm，1.7m），柱溫30℃，樣品管理器溫度15℃，進(jìn)樣體積10L，流速0.4mL/min，流動相A：0.1%甲酸-水（v∶v）；流動相B：0.1%甲酸-乙腈（v∶v）。梯度洗脫條件：0min～2min，10%B；2min～26min，10%～90%B；26min～28min，90%B；28min～29min，90%～10%B；29min～30min，10%B。

1.3.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子化源（ESI），MSEcontinuum模式，采用正離子及負(fù)離子檢測模式。全掃描范圍m/z100～1500。毛細(xì)管電壓3.0kV，錐孔電壓40V，錐孔氣流量50L/h，脫溶劑氮?dú)饬髁?00L/h，氬氣流量0.15mL/min，源溫120℃，脫溶劑氣溫度300℃。采用亮氨酸-腦啡肽[M+H]+=556.277 1、[M-H]=554.262 0作為LockSpray校正標(biāo)準(zhǔn)液（100pg/mL），對儀器進(jìn)行實(shí)時(shí)校正，其校正流速為正離子模式15L/min，使用甲酸鈉溶液對儀器進(jìn)行校正。

2 結(jié)果

采用UPLC-QTOF-MSE模式采集數(shù)據(jù)，使用UNIFI軟件進(jìn)行桑黃化學(xué)成分的自動識別。第1步，通過查閱文獻(xiàn)建立桑黃數(shù)據(jù)庫，作為原有的傳統(tǒng)中藥庫的補(bǔ)充，將化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)保存成.mol格式的文件，將桑黃數(shù)據(jù)庫導(dǎo)入到分析方法中；第2步，將原始數(shù)據(jù)通過WatersCompressionandArchivalToolv1.10軟件進(jìn)行壓縮；第3步，UNIFI軟件自動篩查、鑒定，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的人工提峰、計(jì)算分子式以及分析碎片斷裂情況；第4步，建立一個(gè)過濾篩選方法，設(shè)定質(zhì)量誤差為-5ppm～5ppm，且響應(yīng)值＞4000；第5步，通過結(jié)合碎片離子理論精確質(zhì)量數(shù)、相對保留時(shí)間和分子式匹配軟件Elemental composition、化合物結(jié)構(gòu)匹配軟件MassFragment、離線和（或）在線質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫（PubM-ed、Mass Bank、Chemspider、METLIN）以及相關(guān)文獻(xiàn)對各主要化合物進(jìn)行人工識別和確認(rèn)。

利用UNIFI數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和MassLynx4.1軟件對桑黃提取物進(jìn)行定性分析，正離子、負(fù)離子模式下的質(zhì)譜基峰離子流圖（BPI）（圖1）。在桑黃中檢測到59個(gè)化合物，包括11個(gè)有機(jī)酸及有機(jī)酸酯、7個(gè)苯丙素類、7個(gè)甾體、6個(gè)三萜、5個(gè)黃酮、4個(gè)二萜、5個(gè)酚類。見表1。

圖1 桑黃提取物在正離子模式、負(fù)離子模式下的基峰離子流（BPI）圖Fig.1 Therepresentativebasepeakintensity(BPI)chromatograms of P.igniarius in positive and negative modes

表1 桑黃提取物化學(xué)成分的UPLC-QTOF-MSE鑒定結(jié)果Tab.1 Compounds identified from P.igniarius by UPLC-QTOF-MS/MS

續(xù)表1

續(xù)表1

3 討論

在本研究中，首次運(yùn)用UPLC-Q-TOF-MSE技術(shù)，結(jié)合UNIFI數(shù)據(jù)分析平臺，定性分析了桑黃中的化學(xué)成分。在之前的研究中[8，9]，鑒于在負(fù)離子模式下質(zhì)譜響應(yīng)更強(qiáng)，有人選擇在單一的負(fù)離子模式下進(jìn)行。但是研究發(fā)現(xiàn)，不同類型化合物在不同模式下有不同強(qiáng)度的響應(yīng)值，有些化合物只在單一模式下可以被檢測出來。所以，為了更全面地推測樣品中的化合物，本研究采用了正、負(fù)離子2種質(zhì)譜掃描模式。

UPLC能夠進(jìn)行高效地分離，Q-TOF-MSE具有高靈敏度、高分辨率，能夠進(jìn)行精準(zhǔn)檢測，UNIFI能夠進(jìn)行快速篩查鑒定，將三者結(jié)合，即可實(shí)現(xiàn)快速地分離、檢測、鑒定。Q-TOF-MS的MSE模式獲得數(shù)據(jù)，可通過低碰撞能掃描和高碰撞能掃描之間快速切換同時(shí)完成2種掃描功能的數(shù)據(jù)采集[10]。排除假陽性結(jié)果，同時(shí)進(jìn)行母離子、子離子和中性缺失分析。低能碰撞掃描一般都是6V，能量足夠低，母離子不會斷裂，保留母離子信息；高能碰撞掃描一般在15V～40V呈線性變化，導(dǎo)致產(chǎn)生碎片信息。低能碰撞和高能碰撞獲得的信息再通過保留時(shí)間進(jìn)行關(guān)聯(lián)，為桑黃化學(xué)成分的定性分析提供化合物信息，實(shí)驗(yàn)快速鑒別。

總之，本實(shí)驗(yàn)采用UPLC-Q-TOF-MSE技術(shù)結(jié)合UNIFI數(shù)據(jù)分析平臺對桑黃化學(xué)成分進(jìn)行了快速定性分析，共鑒定了58種化學(xué)成分，包括11個(gè)有機(jī)酸及有機(jī)酸酯、7個(gè)苯丙素類、7個(gè)甾體、6個(gè)三萜、5個(gè)黃酮、4個(gè)二萜、5個(gè)酚類及其它成分，為中藥材化學(xué)成分的分析提供了一種快速檢測的方法，同時(shí)也為桑黃的質(zhì)量控制、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡明提供了科學(xué)依據(jù)。

[1]南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典:2版[K].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006:2784-2785.

[2]H.Chen，T.Tian，H.Miao，et al.Traditional uses，fermentation，phytochemistry and pharmacology of Phellinus linteus:A review[J].Fitoterapia，2016，113:6-26.

[3]C.Z.Wang，N.Q.Zhang，Z.Z.Wang，et al，Rapid characterization of chemical constituents of Platycodon grandiflorum and its adulterant Adenophora stricta by UPLC-QTOF-MS/MS.[J].Journal of Mass Spectrometry，2017，52:643-656.

[4]C.Z.Wang，N.Q.Zhang，Z.Z.Wang，et al.Nontargeted Metabolomic Analysis of Four Different Parts of Platycodon grandiflorum Grown in Northeast China[J].Molecules，2017，22(8):1280.

[5]F.X.Zhang，M.Li，L.R.Qiao，et al.Rapid characterization of Ziziphi Spinosae Semen by UPLC/Qtof MS with novel informatics platform and its application in evaluation of two seeds from Ziziphus species[J].J.Pharm.Biomed.Anal，2016，122:59-80.

[6]L.Deng，A.M.Shi，H.Z.Liu，etal.Identification of Chemical Ingredients of Peanut Stems and Leaves Extracts using UPLCQTOF-MS Coupled With Novel Informatics UNIFI Platform，[J].J.Mass Spectrom，2016，51:1157-1167.

[7]J.F.Tang，W.X.Li，X.J.Tan，et al.A novel and improved UHPLC-QTOF/MS method for the rapid analysis of the chemicalconstituents of Danhong injection[J].Anal.Methods，2016，(8):2904-2914.

[8]李金花，曾銳，瞿燕，等.UPLC-Q-TOF-MS～E技術(shù)結(jié)合UNIFI數(shù)據(jù)庫快速定性分析黃牡丹化學(xué)成分[J].中草藥，2017，48(8):1529-1536.

[9]王美玲，張清清，付爽，等.UPLC-Q-TOF MS～E技術(shù)結(jié)合UNIFI數(shù)據(jù)庫篩查方法快速分析巴戟天化學(xué)成分[J].質(zhì)譜學(xué)報(bào)，2017，38(1):75-82.

[10]閆利利，史家文，王金芳，等.基于UPLC/Q-TOF-MSE方法分析半夏瀉心湯的化學(xué)成分 [J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48(4):526-531.