轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良水稻淀粉品質(zhì)研究進(jìn)展

丁一 丁箐雯 李冰 清沈易 張寧 吳殿星

（浙江大學(xué)應(yīng)用生物科學(xué)系，杭州310029；第一作者：3110100088@zju.edu.cn；*通訊作者：11216028@zju.edu.cn）

淀粉不僅是人類最重要的碳水化合物和首要的能量來(lái)源，也是發(fā)酵和淀粉工業(yè)的主要原料。稻米中含70%～80%的淀粉，包括加工、蒸煮、食用品質(zhì)、糊化、膨脹、粘稠等一系列最終用途均與淀粉品質(zhì)直接相關(guān)。淀粉品質(zhì)改良是水稻最重要的育種目標(biāo)，關(guān)系到品種的專用性、新穎農(nóng)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與生物質(zhì)能的利用等。

水稻是我國(guó)第一大糧食作物，稻米生產(chǎn)對(duì)確保我國(guó)糧食“量與質(zhì)”的安全具有舉足輕重的作用。目前，食用品質(zhì)改良是水稻育種的主要目標(biāo)，以營(yíng)養(yǎng)保健和工業(yè)專用為目標(biāo)的水稻育種尚未規(guī)?；_(kāi)展。根據(jù)不同的應(yīng)用目的，針對(duì)性進(jìn)行基因操縱設(shè)計(jì)淀粉品質(zhì)，以成功培育專用水稻新品種，不僅有助于顯著提高稻米的附加值，也將深化稻米的精深加工、完善稻米的產(chǎn)業(yè)鏈、豐富和擴(kuò)大稻米的應(yīng)用范圍和文化內(nèi)涵，非常符合當(dāng)前供給側(cè)改革的發(fā)展需求。水稻淀粉品質(zhì)受不同的關(guān)鍵基因調(diào)控，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以針對(duì)性對(duì)淀粉品質(zhì)加以修飾改良。本文綜述了國(guó)內(nèi)外采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良水稻淀粉品質(zhì)的研究進(jìn)展。

1 水稻淀粉生物合成途徑中的關(guān)鍵酶及對(duì)應(yīng)基因

淀粉是一種不溶于水的白色粉末狀物質(zhì)，主要由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成，在粳稻、秈稻及糯稻中兩者的含量及比例存在顯著差異。淀粉顆粒是一種典型的半晶體，包含結(jié)構(gòu)規(guī)則的晶體區(qū)和部分不規(guī)則區(qū)域，晶體區(qū)根據(jù)組成的不同可以分為A、B、C和V型。

作為碳水化合物的重要儲(chǔ)存者，淀粉在植物的生長(zhǎng)周期中扮演著重要的角色。淀粉的生物合成始于光合作用合成葡萄糖，然后轉(zhuǎn)化為蔗糖。蔗糖通過(guò)源庫(kù)運(yùn)輸進(jìn)入籽粒，在蔗糖合酶（Sucrose synthase，SuSy）的催化作用下可逆分解形成尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-Glucose，UDPG）和果糖（Frutcose），或在蔗糖轉(zhuǎn)化酶（Invertase，Inv）作用下不可逆裂解成葡萄糖和果糖，水稻胚乳中的淀粉合成過(guò)程主要以前者為主。接著UDPG在尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）作用下可逆地轉(zhuǎn)化為葡萄糖和尿苷三磷酸（UTP）。果糖在果糖激酶（Fructokinase，F(xiàn)RK）作用下不可逆催化生成果糖-6-磷酸（F-6-P）；UDPG在UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucose pyrophosphorylase，UGPase）作用下轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）。磷酸己糖間很容易在糖酵解和其他途徑的代謝循環(huán)中通過(guò)磷酸葡糖異構(gòu)酶（Phosphoglucoseisomerase，PGI）和葡萄糖磷酸變位酶（Phosphoglucomutase，PGM）進(jìn)行相互轉(zhuǎn)換，最終以葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）的形式流入淀粉合成方向。然后G-1-P在腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase）作用下轉(zhuǎn)化為用于合成淀粉的糖基單元腺苷二磷酸葡萄糖（ADP-glucose，ADPG）。ADPG通過(guò)位于造粉體膜上特異的ADP-葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ADP-glucose translocator，AGT）進(jìn)入造粉體，過(guò)程見(jiàn)圖1[1-2]。

淀粉的生物合成過(guò)程受多種酶的調(diào)控，其中關(guān)鍵的有ADPG合成酶AGP、淀粉合成酶SS、分支酶SBE和去分支酶DBE。其中，SS又可以分為GBSS、SSI、SSII、SSIII、SSⅣ、SSⅤ，SBE包括BEI及BEII，DBE可以分為ISA（EC3.2.1.68）和PUL（EC3.2.1.41）。ADPG合成酶AGP（EC2.7.7.27）主要負(fù)責(zé)在ATP存在的條件下，催化G-1-P形成ADPG；淀粉合成酶SS（EC2.4.1.21）主要負(fù)責(zé)葡聚糖鏈的延伸；分支酶SBE（EC2.4.1.18）通過(guò)水解糖苷鍵，再通過(guò)糖苷鍵將斷裂處連接，進(jìn)而形成分支結(jié)構(gòu)；去分支酶DBE降解SBE形成的支鏈。上述酶都存在同工酶，例如，水稻中有一種SSI、三種SSII、兩種SSIII、兩種SSⅣ、一種SSⅤ以及兩種GBSS同工酶。現(xiàn)已知的在水稻中編碼AGP的基因有7個(gè)，AGP-S1、AGP-S2a、AGP-S2b、AGP-L1、AGPL2、AGP-L3、AGP-L4；編碼SSI基因ss1，缺失后在淀粉含量上無(wú)明顯差異；SSII基因SS2a、SS2b，主要功能為調(diào)節(jié)鏈長(zhǎng)的分布；SSIII基因ss3a、ss3b，作用主要為在長(zhǎng)鏈上連接并延伸支鏈；SSⅣ基因ss4b、ss4a和BEI基因be1，可特異性地延長(zhǎng)支鏈；BEⅡ基因be2a、be2b（ae），前者主要與淀粉合成的初始相關(guān)，后者主要用于合成支鏈淀粉分支上的短鏈；ISA1基因isa1（sug-1），ISAⅡ基因isa2，ISAⅢ基因isa3，PUL基因pul，其作用主要為修剪產(chǎn)生的不當(dāng)分支；GBSSⅠ基因gbss1（wx），缺失后的突變體表現(xiàn)為全支鏈淀粉的形式等。上述基因均對(duì)水稻淀粉品質(zhì)有影響[3-4]。

圖1 水稻胚乳淀粉合成過(guò)程

2 水稻淀粉品質(zhì)轉(zhuǎn)基因改良研究

2.1 轉(zhuǎn)AGP基因提高總淀粉含量

淀粉的生物合成經(jīng)歷幾個(gè)步驟，其中需要ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）的催化作用，水稻種子中AGPase的變構(gòu)特性對(duì)淀粉的合成影響顯著。

轉(zhuǎn)AGP基因水稻試驗(yàn)中的目的基因在現(xiàn)有研究中多源自微生物，所獲得轉(zhuǎn)基因水稻的總淀粉含量在一些研究中明顯增加，而在另外的一些研究中未發(fā)現(xiàn)顯著變化。Sakulsingharoj等[5]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將源自大腸桿菌的glgc-TM基因?qū)胨痉N子中，該基因主要編碼一種具有催化活性的變構(gòu)不敏感酶——ADP-葡萄糖焦磷酸化酶。該酶在轉(zhuǎn)基因水稻胚乳中的細(xì)胞質(zhì)及淀粉體中成功表達(dá)，結(jié)果使總淀粉含量和種子重量均有所增加。宋敏等[6]通過(guò)轉(zhuǎn)細(xì)菌AGPase突變子glgc16基因得到轉(zhuǎn)基因水稻，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因水稻的千粒重提高了5.6%～22.0%，但總淀粉含量無(wú)顯著差異。

2.2 轉(zhuǎn)SS基因調(diào)控直鏈淀粉含量

2.2.1 轉(zhuǎn)反義Wx基因降低直鏈淀粉含量

對(duì)轉(zhuǎn)淀粉合成酶基因的研究較多，主要集中于GBSSI。GBSSI基因，即Wx基因，編碼直鏈淀粉合成的淀粉合成酶，位于第6號(hào)染色體，由14個(gè)外顯子和13個(gè)內(nèi)含子組成。在水稻中，已知Wx基因有Wxa和Wxb 2個(gè)等位基因，分別集中在秈和粳兩種類型的水稻中，前者蛋白活性約為后者的10倍[7]。

直鏈淀粉含量是評(píng)價(jià)稻米品質(zhì)的重要理化指標(biāo)，中等適宜的直鏈淀粉含量對(duì)稻米食味品質(zhì)具有至關(guān)重要的決定作用。通過(guò)導(dǎo)入Wx反義基因，調(diào)控水稻的直鏈淀粉含量，可以得到直鏈淀粉含量明顯減少的轉(zhuǎn)基因植株[8-10]。Shimada等[11]用水稻W(wǎng)x基因外顯子4和9之間的一個(gè)1.0 kb片段與35S啟動(dòng)子反向連接，然后采用電激法將其導(dǎo)入水稻原生質(zhì)體中，得到了直鏈淀粉含量明顯減少的植株。Terada等[9]將2.3kb的反向Wx cDNA（其中包含450 bp的Wx基因第1內(nèi)含子片段）與玉米乙醇脫氫酶（Adhl）啟動(dòng)子連接，構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)化獲得一批轉(zhuǎn)基因植株，這些轉(zhuǎn)基因植株在花粉和胚乳中的直鏈淀粉含量都有所下降。陳秀花等[12]在轉(zhuǎn)反義Wx基因水稻植株中獲得了1株直鏈淀粉含量由野生型的25.4%下降到7.02%的轉(zhuǎn)基因植株。

2.2.2 轉(zhuǎn)DUL、SSS、SSIIa基因降低直鏈淀粉含量

Zeng等[13]將8285bp的含全部Dul編碼區(qū)域及部分上下游區(qū)域的DNA片段采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法及電擊法導(dǎo)入dul突變體水稻中。Dul基因編碼了1個(gè)Prp1蛋白，該蛋白與mRNA前體的剪接有關(guān)。dul突變體比之野生型，由于Wxb前體mRNA轉(zhuǎn)錄水平降低了30%左右，直鏈淀粉含量顯著降低。

胡昌泉等[14]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將可溶性淀粉合成酶基因（SSS）和淀粉分支酶基因（SBE）導(dǎo)入秈稻恢復(fù)系明恢86中，導(dǎo)致直鏈淀粉含量大幅度降低。

Fujita等[15]將源自秈稻品種的有活性的SSIIa導(dǎo)入粳稻背景的isa1突變體中，在突變體中不可溶a-葡聚糖含量只有3.1%，而在轉(zhuǎn)基因植株中其含量超過(guò)60%。在突變體中可溶性成分占總a-葡聚糖大于95%，在轉(zhuǎn)基因植株中只有35%～70%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SSIIa只會(huì)延長(zhǎng)一些外部鏈及a-葡聚糖并導(dǎo)致不可溶性增加。

表1 水稻淀粉生物合成中的四種關(guān)鍵酶及對(duì)應(yīng)基因

2.2.3 轉(zhuǎn)Wx基因增加直鏈淀粉含量

Liu等[16]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將源自水稻包含756bp的反義Wx基因DNA片段及gusA編碼序列與3.1kb的水稻W(wǎng)x啟動(dòng)子融合，獲得轉(zhuǎn)基因水稻植株。所得的秈稻轉(zhuǎn)基因植株，其直鏈淀粉含量表現(xiàn)出較高水平?；蚍治霰砻?，該轉(zhuǎn)基因及其高直鏈淀粉含量特性均可穩(wěn)定遺傳。

Crofts等[17]將1個(gè)秈稻中的主效Wxa基因轉(zhuǎn)到粳稻的waxy（gbss1）突變體中，突變體的直鏈淀粉含量只有25%，轉(zhuǎn)基因植株的直鏈淀粉含量高達(dá)41%，而支鏈淀粉的鏈長(zhǎng)分布在突變體和轉(zhuǎn)基因植株間無(wú)顯著差異。結(jié)果表明，GBSSI對(duì)表觀直鏈淀粉含量有影響。Hanashiro等[18]通過(guò)將編碼GBSSI的Wx基因?qū)隬x缺失的突變體中，發(fā)現(xiàn)其表觀直鏈淀粉含量從原來(lái)難以檢測(cè)到的極微量增加到淀粉總量的21.6%～22.2%。

2.3 轉(zhuǎn)SBE基因提高直鏈淀粉和抗性淀粉含量

轉(zhuǎn)淀粉分支酶基因的研究也獲得重要進(jìn)展。通過(guò)導(dǎo)入雙抑制基因，獲得了高直鏈淀粉轉(zhuǎn)基因植株，其抗性淀粉含量也顯著提高，同時(shí)對(duì)其晶體結(jié)構(gòu)、物理生化特性也有一系列明顯的影響。

Tanaka等[19]將18kb的包括OSBEIIb基因及其啟動(dòng)子區(qū)的DNA片段導(dǎo)入be2b突變體，得到了從低到高具有表達(dá)梯度的一系列轉(zhuǎn)基因植株。研究結(jié)果表明，該基因的表達(dá)與聚合度DP 6-14的支鏈淀粉及糊化溫度密切相關(guān)。由于OSBEIIb基因的表達(dá)，突變體中原來(lái)的B型淀粉晶體在轉(zhuǎn)基因植株中轉(zhuǎn)變?yōu)锳型晶體。這些結(jié)果表明，BEIIb在支鏈淀粉中短鏈的形成中起到重要作用，對(duì)支鏈淀粉的晶體結(jié)構(gòu)及糊化溫度有影響。

Butardo等[20]通過(guò)構(gòu)建SBEIIbRNA沉默表達(dá)體系獲得了SBEIIb酶活抑制的轉(zhuǎn)基因植株，分析其去分支淀粉的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因植株加倍的表觀直鏈淀粉含量不是由于直鏈淀粉比例的增加，而是因?yàn)橹ф湹矸壑虚L(zhǎng)鏈水平的增加。抑制SBEIIb酶對(duì)獲得更高的抗性淀粉以降低血糖指數(shù)具有重要意義。

Zhu等[21]通過(guò)導(dǎo)入雙反義基因獲得了雙抑制SBEI和SBEIIb的秈稻轉(zhuǎn)基因植株，該2個(gè)基因的表達(dá)完全被抑制，顆粒結(jié)合淀粉合成酶的表達(dá)情況正常，與野生型相比，其表觀直鏈淀粉含量從27.2%提高到了64.8%，抗性淀粉含量從0%到14.6%，總膳食纖維從6.8%提高到了15.2%。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，得到的高直鏈淀粉轉(zhuǎn)基因水稻主要為B型淀粉晶體結(jié)構(gòu)，支鏈淀粉部分長(zhǎng)鏈比例顯著增加，糊化溫度升高，半復(fù)合淀粉顆粒導(dǎo)致淀粉抗性增加[22]。Wei等[23-24]隨后的研究發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株的凝膠溫度更高，糊化焓和膨脹能力降低。在75℃后，野生型從A型淀粉晶體轉(zhuǎn)變?yōu)椴欢ㄐ螒B(tài)，而轉(zhuǎn)基因植株則從C型轉(zhuǎn)變?yōu)锽型淀粉晶體，95℃時(shí)才變?yōu)椴欢ㄐ螒B(tài)。Man等[25-27]消化實(shí)驗(yàn)表明，轉(zhuǎn)基因植株的淀粉晶體結(jié)構(gòu)及顆粒外部區(qū)域的雙螺旋結(jié)構(gòu)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株耐消化性能的提高。

Sun等[28]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將35S啟動(dòng)子構(gòu)建的淀粉分支酶1基因OsSbe1的過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入水稻，轉(zhuǎn)基因植株的表觀直鏈淀粉含量在糙米中介于10.6%～25.0%之間（半數(shù)表現(xiàn)為含量顯著降低，少部分增加20.0%以上），而野生型為18.0%。

2.4 轉(zhuǎn)DBE基因優(yōu)化支鏈淀粉的精細(xì)結(jié)構(gòu)

Fujita等[29]通過(guò)轉(zhuǎn)反義ISA1基因的方法獲得了ISA1活性被抑制的轉(zhuǎn)基因水稻植株。該轉(zhuǎn)基因水稻中聚合度DP≤11的短鏈支鏈淀粉含量豐富，這是由于ISA1主要作用于支鏈淀粉分子，對(duì)不恰當(dāng)分支進(jìn)行整理。相較于isa1突變體，轉(zhuǎn)反義ISA1植株由于剩余ISA1活性為野生型的1/16，遠(yuǎn)高于isa1突變體的1/100，其表型沒(méi)有突變體明顯。

2.5 轉(zhuǎn)其他外源基因改良淀粉品質(zhì)

除直接對(duì)水稻內(nèi)相關(guān)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因調(diào)控淀粉品質(zhì)之外，一些源自其他生物的基因也被導(dǎo)入水稻，獲得了一些淀粉品質(zhì)發(fā)生改變的轉(zhuǎn)基因植株。

Krishnamurthy等[30]將小麥硬度主效基因PINA和PINB導(dǎo)入到水稻中，獲得的轉(zhuǎn)基因水稻的谷粒質(zhì)地柔軟，研磨后淀粉顆粒損傷水平顯著降低、完整淀粉顆粒結(jié)構(gòu)比例上升。

Chiang等[31]將源自嗜熱厭氧乙醇桿菌Thermoanaerobacter ethanolicus 39E的2865bp編碼75-1029個(gè)成熟APU（支鏈淀粉酶）的DNA序列及aAmy的下游或GluB啟動(dòng)子加上aAmy或GluB的信號(hào)肽序列分別導(dǎo)入水稻。研究發(fā)現(xiàn)，在成熟的種子中采用GluB-1啟動(dòng)子的比其余啟動(dòng)子的表達(dá)水平高，在發(fā)芽過(guò)程中，aAmy8作為啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)量最高，直鏈淀粉含量降低，可溶性蔗糖含量增加。

大麥中的糖信號(hào)分子（Sugar signalling in barley 2，SUSIBA2）是一種只存在于植物的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)糖分子誘導(dǎo)的基因表達(dá)。Su等[32]將該基因?qū)胨?，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株在降低甲烷排放量的同時(shí)，植株成熟種子及莖中淀粉含量顯著增加。

3 問(wèn)題與展望

通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)水稻淀粉品質(zhì)進(jìn)行調(diào)控主要有兩種目的：一是改良水稻的淀粉理化特性，包括增加總淀粉含量、適度降低直鏈淀粉含量以及優(yōu)化直鏈淀粉與支鏈淀粉的配比等；二是增進(jìn)淀粉品質(zhì)性狀相關(guān)基因的遺傳基礎(chǔ)認(rèn)識(shí)，采取過(guò)表達(dá)或抑制關(guān)鍵基因的方法，進(jìn)一步闡釋基因的功能，同時(shí)獲得與原淀粉固有性質(zhì)不同的轉(zhuǎn)基因水稻。

對(duì)水稻淀粉品質(zhì)進(jìn)行改良，主要依賴傳統(tǒng)育種方式，周期長(zhǎng)，效果不明顯；通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良水稻淀粉品質(zhì)尚處于初級(jí)階段，主要針對(duì)目的基因多為造粉體中直接作用于淀粉合成的酶基因，對(duì)上游基因的調(diào)控及影響研究仍不明確。隨著對(duì)水稻淀粉生物合成的深入了解及對(duì)其基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的解析，轉(zhuǎn)基因技術(shù)可望更廣泛用于水稻淀粉品質(zhì)的精確修飾或定向改良。

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