酶放大免疫測(cè)定技術(shù)法檢測(cè)丙戊酸藥物濃度的動(dòng)態(tài)飄逸校正系數(shù)

周清武

（四川省綿陽(yáng)市中心醫(yī)院藥學(xué)部，四川 綿陽(yáng) 621000）

丙戊酸為臨床常用抗癲癇藥物，具有阻止異常放電的擴(kuò)散作用，對(duì)所有類型的癲癇都有效，是小發(fā)作的首選藥，長(zhǎng)期毒性低，不良反應(yīng)少，主要用于單純或復(fù)雜失神發(fā)作、肌陣攣發(fā)作，大發(fā)作的單藥或合并用藥治療，對(duì)復(fù)雜部分性發(fā)作也有一定療效[1-3]，還可治療情感障礙及躁狂癥等精神疾病[4-6]。由于丙戊酸血藥濃度個(gè)體差異大，安全范圍窄，治療指數(shù)低[7-8]，高濃度所致震顫、共濟(jì)失調(diào)、煩躁和木僵等中毒反應(yīng)與無(wú)效癥狀相似[9-11]，易導(dǎo)致治療無(wú)效或中毒。通過(guò)治療藥物監(jiān)測(cè)（therapeutic drug monitoring，TDM），可以指導(dǎo)臨床個(gè)體化合理用藥。酶放大免疫測(cè)定技術(shù)（enzyme multiplied immunoassay technique，EMIT）是目前TDM監(jiān)測(cè)的主要手段之一，儀器自動(dòng)化程度高，可多品種多樣本連續(xù)檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間短，樣品處理簡(jiǎn)單[12]；試劑盤瓶中的試劑較多時(shí)，相鄰質(zhì)控檢測(cè)重復(fù)性很好;缺點(diǎn)是試劑昂貴，試劑盤瓶中的試劑較少與較多的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控檢測(cè)比較，重復(fù)性較差[13-14]；偏差的規(guī)律性很強(qiáng)，呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)飄逸現(xiàn)象，在批量檢測(cè)較少的試驗(yàn)中尤為突出，過(guò)去常用多次定標(biāo)或質(zhì)控來(lái)糾正較大偏差，但試劑浪費(fèi)較大。動(dòng)態(tài)飄逸現(xiàn)象是指EMIT法檢測(cè)丙戊酸血漿樣品時(shí)，隨著試劑盤瓶中試劑檢測(cè)次數(shù)的增加，試劑揮發(fā)導(dǎo)致試劑濃縮，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控的實(shí)測(cè)濃度會(huì)持續(xù)向上飄逸[15]，試劑越少，飄逸值越大。為獲取準(zhǔn)確的丙戊酸血藥濃度檢測(cè)數(shù)據(jù)，本研究中推擬了EMIT法檢測(cè)人血漿丙戊酸藥物濃度的動(dòng)態(tài)飄逸校正系數(shù)，可以動(dòng)態(tài)校正丙戊酸實(shí)測(cè)濃度的飄逸值，減少試劑浪費(fèi)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Viva-E型全自動(dòng)生化儀（德國(guó) Siemens公司）；VORTEX-5型漩渦混合器（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；TDL-60B型普通臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；微量移液器（上海求精生化儀器廠）。

1.2 試藥

丙戊酸檢測(cè)試劑盒（siemens healthcare diagnostics公司，批號(hào)為4G019UL-J2），包括丙戊酸抗體試劑A和酶試劑B；丙戊酸定標(biāo)液（siemens healthcare diagnostics公司，批號(hào)為4G109UL-G4）；丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為100963-201302）。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

2.1.1 儀器系統(tǒng)

定期比色盤及針清洗，保持較低的盤空白標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，屏蔽空白值偏差較大的比色杯。系統(tǒng)液體管路不漏氣，系統(tǒng)用純化水電導(dǎo)率小于10 μs／cm，裝滿桶后立即加蓋密封，靜置24 h以上，自然排盡水中空氣，且盡可能新鮮，以減少微生物污染和生長(zhǎng)機(jī)會(huì)，保持試劑和樣品注射器內(nèi)無(wú)氣泡。

2.1.2 丙戊酸標(biāo)準(zhǔn)溶液

丙戊酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，鈉鹽水溶性好，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定。50 μg／mL的丙戊酸標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控水溶液，可用丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品適量，加滅菌注射用水溶解并稀釋成50 μg／mL，取100 mL置200 mL磨口玻璃試劑瓶，與丙戊酸定標(biāo)液一樣，存于2～8℃冰箱中，能保持較長(zhǎng)時(shí)期的濃度穩(wěn)定。試驗(yàn)表明，丙戊酸標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控水溶液，在2～8℃冰箱中，密封保存3年，質(zhì)量濃度下降率低于3%。

2.1.3 丙戊酸檢測(cè)試劑

將在2～8℃冰箱中冷藏的試劑，置26℃水浴中5 min，可平衡至室溫，檢測(cè)結(jié)束時(shí)，立即封蓋并放回2～8℃冰箱中，盡量縮短室溫放置時(shí)間，以保持試劑穩(wěn)定。

2.2 動(dòng)態(tài)飄逸現(xiàn)象及原因分析

現(xiàn)象：本研究在大量的EMIT法檢測(cè)丙戊酸血藥濃度過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，隨著試劑檢測(cè)次數(shù)的增加，檢測(cè)試劑逐漸減少，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控的實(shí)測(cè)質(zhì)量濃度會(huì)逐漸升高，且初期升高系數(shù)較小，后逐漸變大，呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)飄逸現(xiàn)象，具有非常穩(wěn)定的規(guī)律性，即“試劑瓶底效應(yīng)”[15-16]。

原因分析：試劑瓶口內(nèi)徑1.4 cm，單個(gè)樣品檢測(cè)需時(shí)14 min，多個(gè)樣品批量檢測(cè)，每增加1個(gè)樣品，需增加0.5 min，本實(shí)驗(yàn)室多為單個(gè)樣品檢測(cè)。檢測(cè)試劑瓶底吹16.5℃冷風(fēng)，溶劑揮發(fā)導(dǎo)致試劑濃縮，應(yīng)是引起EMIT法檢測(cè)丙戊酸標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控藥物濃度產(chǎn)生上翹飄逸的根本原因。

2.3 動(dòng)態(tài)飄逸校正系數(shù)的方法推擬

2.3.1 相關(guān)的假定與公式推導(dǎo)

EMIT法檢測(cè)丙戊酸的多次試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控的檢測(cè)濃度存在動(dòng)態(tài)飄逸現(xiàn)象，假定飄逸系數(shù)（k），其公式為：

因試劑揮發(fā)與檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)有關(guān)，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，單個(gè)樣品檢測(cè)需時(shí)14 min，多個(gè)樣品批量檢測(cè)，每增加1個(gè)樣品，需增加0.5 min，認(rèn)定每14 min的樣本檢測(cè)為1個(gè)檢測(cè)次數(shù)(n)值時(shí)長(zhǎng)單位，每增加到14 min時(shí)，n值就加1，并且n值從新試劑盒被定標(biāo)后或首次質(zhì)控檢測(cè)起開(kāi)始計(jì)算。

又假定第 n次檢測(cè)前的每次檢測(cè)濃度增加的平均系數(shù)為 a；那么第1次檢測(cè)的飄逸系數(shù)就為（1+a），第2 次檢測(cè)的飄逸系數(shù)為（1+a）×（1+a），第 3 次檢測(cè)的飄逸系數(shù)為（1+a）3，以此類推，第 n次檢測(cè)的飄逸系數(shù)為（1+a）n，即得公式：

將(2）式代入(1）式，可得：

當(dāng) n值較大時(shí)做一個(gè)質(zhì)控檢測(cè)，在(3）式中，已知C測(cè)定，n，C標(biāo)準(zhǔn)，容易計(jì)算出一個(gè) n值對(duì)應(yīng)的 a值，標(biāo)記為a1。

后來(lái)發(fā)現(xiàn)，a值也同樣存在動(dòng)態(tài)飄逸現(xiàn)象，呈現(xiàn)先小后大的上翹拋物線，試想，拋物線可用指數(shù)函數(shù)來(lái)描述，假定指數(shù)函數(shù)的系數(shù)為 b，指數(shù)為 c，變量為 n，那么就存在一個(gè)指數(shù)函數(shù)：

如果用更大的 n值再做一個(gè)質(zhì)控檢測(cè)，按(3）式計(jì)算，同樣可得一個(gè) a2值。在(4）式中容易看出，2個(gè)不同的 n值做了質(zhì)控檢測(cè)后，a值和對(duì)應(yīng)的 n值已經(jīng)知道，只有 b，c為未知數(shù)，得二元一次方程組：a1=b×n1c，a2=b× n2c，得 b，c值。

將(4）式代入（3）式得：

由(1）式知，C標(biāo)準(zhǔn)=（1／k）× C測(cè)定，令 1／k=k′，k′即為將實(shí)測(cè)濃度換算為真實(shí)濃度的動(dòng)態(tài)飄逸校正系數(shù)，即：

2.3.2 a，b，c值的計(jì)算

本研究中用自配的50 μg／mL丙戊酸標(biāo)準(zhǔn)水溶液做質(zhì)控檢測(cè)。因 n值較小時(shí)，實(shí)測(cè)濃度的飄逸值也較小，故考慮在第50，100次檢測(cè)前后各取1個(gè)點(diǎn)做標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控檢測(cè)，計(jì)算出來(lái)的 a，b，c值會(huì)更準(zhǔn)確一些。第48次檢測(cè)濃度為 C48=65.5 μg／mL， C108=129.5 μg ／mL，由(3）式可解： a48=e[ln(65.5 ／50)／48]-1=0.005 64；a108=e[ln(129.5 ／50)／108]-1=0.008 85。再由(4）式得二元一次方程組：0.005 64=b×48c，0.00885=b×108c，得 b=0.00066，c=0.55535。

2.4 推擬結(jié)果

2.4.1 推擬得到的動(dòng)態(tài)飄逸系數(shù)

將 b，c值代入(6）式，即得丙戊酸標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控檢測(cè)的動(dòng)態(tài)飄逸系數(shù)：k= （1+0.000 66 × n0.55535）n，用飄逸系數(shù)對(duì)檢測(cè)次數(shù)可作圖1推擬圖。

圖1 丙戊酸質(zhì)控檢測(cè)動(dòng)態(tài)飄逸系數(shù)與檢測(cè)次數(shù)的曲線圖

2.4.2 推擬得到的動(dòng)態(tài)飄逸校正系數(shù)

由（7）式可知，丙戊酸標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控檢測(cè)的動(dòng)態(tài)飄逸校正系數(shù)為： k′=1 ／[（1+0.000 66 × n0.55535）n]，即為本研究的核心成果。

2.5 動(dòng)態(tài)飄逸校正系數(shù)的試驗(yàn)驗(yàn)證與應(yīng)用

以50 μg／mL丙戊酸標(biāo)準(zhǔn)水溶液為質(zhì)控樣品，分別在試劑盒的第 1，20，31，97，120，135 次測(cè)試時(shí)做質(zhì)控試驗(yàn)，檢測(cè)濃度用動(dòng)態(tài)飄逸校正系數(shù)校正，相對(duì)誤差在±6%以內(nèi)，符合《中國(guó)藥典》對(duì)生物樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確度在±15%以內(nèi)的規(guī)定[17]。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 動(dòng)態(tài)飄逸校正系數(shù)的試驗(yàn)驗(yàn)證

2.6 不同批次丙戊酸檢測(cè)試劑盒之間的 k值比較

在近期使用的2個(gè)不同批次丙戊酸檢測(cè)試劑盒之間，相同方法得到2個(gè)不同的動(dòng)態(tài)飄逸系數(shù)，當(dāng) n=140時(shí)，k1=4.178，k2=4.485，測(cè)定濃度與飄逸系數(shù)的高低值比較，偏差同為7.35%，符合《中國(guó)藥典》規(guī)定。

2.7 室溫變化對(duì)丙戊酸檢測(cè)濃度的影響

EMIT法檢測(cè)藥物濃度的室溫要求在18～25℃，室溫變化對(duì)質(zhì)控檢測(cè)結(jié)果會(huì)有較大影響，盡量保持室溫與定標(biāo)或質(zhì)控室溫一致，如果溫差低于2℃，可以減少溫度對(duì)檢測(cè)結(jié)果的不良影響[13-14]。試驗(yàn)顯示，室溫每升高（或降低）1℃，丙戊酸檢測(cè)濃度平均增加（或減少）2.5%。室溫 25，24，23，22，21 ℃時(shí)測(cè)定質(zhì)量濃度分別為104，102，100，97，94 μg ／mL。

3 討論

3.1 試劑濃縮與檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)

批量檢測(cè)越多，檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)越短，試劑濃縮越少，飄逸系數(shù)越小。樣品盤有51個(gè)樣本位，如果丙戊酸的1個(gè)試劑盒檢測(cè)140個(gè)樣本，單個(gè)樣品檢測(cè)需要的最大時(shí)長(zhǎng)為14×140=1 960 min，批量樣品檢測(cè)需要的最小時(shí)長(zhǎng)為（14+0.5×50）×2+（14+0.5×37）=111 min，約合 8 個(gè)單位的檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)，即如果1個(gè)試劑盒全部滿盤進(jìn)行丙戊酸批量檢測(cè)，n為8，k為1.017，檢測(cè)偏差會(huì)小于 2%。故盡可能批量檢測(cè)，可以有效減小檢測(cè)濃度的動(dòng)態(tài)飄逸系數(shù)。同時(shí)，為減少試劑揮發(fā)，檢測(cè)結(jié)果出來(lái)后應(yīng)盡快密封試劑瓶。

由 a=0.000 66× n0.55535可知，當(dāng) n=1 時(shí)，a=0.066%；當(dāng) n=140時(shí)，a=1.027%，即 a值的漸增區(qū)間為 0.066% ～1.027%。

3.2 k 與 k′值的實(shí)際應(yīng)用

使用 k值，可預(yù)知丙戊酸實(shí)測(cè)濃度的飄逸倍數(shù)，由k= （1+0.000 66 × n0.55535）n可知，當(dāng)檢測(cè)次數(shù) n ＞ 32時(shí)，飄逸系數(shù) k＞1.15，檢測(cè)偏差會(huì)超過(guò)《中國(guó)藥典》對(duì)生物樣品的最大偏差限制（＜15%），應(yīng)引起血藥濃度監(jiān)測(cè)工作者的注意。當(dāng) n=140時(shí)，k為 4.178，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控的檢測(cè)濃度會(huì)增加3.178倍。因丙戊酸檢測(cè)的最大濃度限為 150 μg／mL，k在2～4范圍時(shí)，檢測(cè)前先將全血樣品用注射用水稀釋2～4倍，檢測(cè)結(jié)果再放大2～4倍計(jì)算，可以有效減少中高濃度全血樣品引起的超限檢測(cè)。使用 k′值，可將丙戊酸實(shí)測(cè)濃度換算為真實(shí)濃度。

3.3 出現(xiàn)較大偏差的糾正方法

過(guò)去，本實(shí)驗(yàn)室首先考慮的是重新定標(biāo)，那是當(dāng)時(shí)掌握的唯一方法，優(yōu)點(diǎn)是重新獲得定標(biāo)曲線，短期內(nèi)準(zhǔn)確度較高，缺點(diǎn)是會(huì)浪費(fèi)大量的昂貴試劑，但不久后又會(huì)再次出現(xiàn)較大偏差，不得不再次定標(biāo)，在批量檢測(cè)較少的實(shí)驗(yàn)室必然會(huì)出現(xiàn)較大虧損。后來(lái)，以質(zhì)控校正方法為主，優(yōu)點(diǎn)是短期準(zhǔn)確度較好，有人主張盡量批量檢測(cè)，在1個(gè)樣品盤的中間位置，放置1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控樣品，可以解決1個(gè)批次的檢測(cè)準(zhǔn)確性問(wèn)題[18-19]。缺點(diǎn)是不適合以單個(gè)樣品檢測(cè)為主的實(shí)驗(yàn)室，否則會(huì)因經(jīng)常質(zhì)控對(duì)而浪費(fèi)較多試劑。目前，使用動(dòng)態(tài)飄逸校正系數(shù)方法的優(yōu)點(diǎn)是校正后得到的丙戊酸血藥濃度數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度高，可以用到最后一滴可測(cè)試劑，試劑浪費(fèi)少。EMIT法檢測(cè)丙戊酸藥物濃度的動(dòng)態(tài)飄逸系數(shù)在單個(gè)樣品檢測(cè)過(guò)程中的變化較大，掌握這種變化現(xiàn)象的產(chǎn)生原因、規(guī)律及解決辦法，對(duì)丙戊酸藥物濃度監(jiān)測(cè)工作有非常大的益處。

3.4 室溫變化對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響

如果溫差較小，可用溫度系數(shù)予以校正，即與定標(biāo)或質(zhì)控室溫比較，每升高1℃，計(jì)算濃度就減少2.5%；反之，每降低1℃，計(jì)算濃度就增加2.5%。

3.5 其他

在有限試劑盒得出的研究結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，EMIT法檢測(cè)丙戊酸藥物濃度的動(dòng)態(tài)飄逸校正系數(shù)，在不同批次試劑盒之間的波動(dòng)較小，即可在不同試劑盒之間使用。另外，不同試劑盒之間的質(zhì)量濃度，有可能不完全一致，為確保本研究成果的準(zhǔn)確應(yīng)用，在使用新的丙戊酸檢測(cè)試劑盒時(shí)，首次做標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控檢測(cè)是必要的，如果有偏差，可計(jì)算一個(gè)試劑校正系數(shù)，將新舊試劑盒校正一致，這樣就可以代替新購(gòu)丙戊酸試劑盒的常規(guī)定標(biāo)，平時(shí)只需偶爾抽驗(yàn)質(zhì)控，就能防止意外情況的發(fā)生。

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