丹參川芎嗪對(duì)兔耳增生性瘢痕的抑制作用研究

馮登超，高棟梁，白翠翠，高東東 ，武 斌，薛宏斌，楊喜明

（延安大學(xué)附屬醫(yī)院燒傷整形手外科，陜西 延安 716000）

增生性瘢痕多發(fā)于損傷深度累及真皮的創(chuàng)傷，與正常瘢痕相比，其形成過(guò)程中成纖維細(xì)胞增殖更活躍，膠原蛋白沉積更明顯，導(dǎo)致真皮纖維化更顯著[1]。目前，其治療方法主要有藥物、壓迫、放射、激光及外科手術(shù)等，但均無(wú)絕對(duì)的權(quán)威性[2]。研究證實(shí)，早期應(yīng)用丹芎瘢痕涂膜[3]和維芎瘢痕霜[4]可明顯抑制增生性瘢痕的增生。因此，如何調(diào)控瘢痕使其增生至適當(dāng)程度，成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。丹參川芎嗪注射液的主要化學(xué)成分為丹參素和川芎嗪，具有抑制炎癥[5]、抗纖維化[3]作用。本研究中采用兔耳瘢痕模型，觀察了丹參川芎嗪對(duì)增生性瘢痕組織的影響，為增生性瘢痕防治藥物的臨床應(yīng)用及開發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

丹參川芎嗪注射液（貴州拜特制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字 H52020959，批號(hào)為20150512，規(guī)格為每支 5 mL）；鼠抗兔增殖細(xì)胞核抗原蛋白(PCNA)單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz公司）；三步法染色試劑盒和DAB試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模

取日本大耳白兔 16只，體質(zhì)量 2.0～2.5 kg，雌雄不論，購(gòu)自延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分籠飼養(yǎng)。將動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，參照文獻(xiàn)[6-7]方法，以30 g／L戊巴比妥鈉(30 mg／kg)作耳緣靜脈麻醉，兔耳腹側(cè)面皮膚碘伏、乙醇消毒，嚴(yán)格無(wú)菌操作技術(shù)下，在兔耳腹側(cè)中段沿長(zhǎng)軸避開可見血管，作1 cm×1 cm大小創(chuàng)面，創(chuàng)面間隔1 cm以上，去掉兔耳全層皮膚，并用刮勺徹底刮除軟骨膜，創(chuàng)緣用電烙鐵燒灼，每耳6處，共192個(gè)創(chuàng)面，術(shù)后創(chuàng)面暴露，待其自行愈合后形成瘢痕增生塊。瘢痕組織高度不低于2 mm，硬度與兔耳軟骨相似時(shí)即為增生性瘢痕[8]。

1.2.2 動(dòng)物分組及處理

分組：取16只日本大耳白兔，共制備192個(gè)全層皮膚缺損創(chuàng)面，傷后21 d創(chuàng)面均出現(xiàn)上皮化，局部注射丹參川芎嗪液。用微量注射器從創(chuàng)面周圍的正常皮膚進(jìn)針向中央內(nèi)注射，致瘢痕變蒼白并稍隆起。注射量每個(gè)瘢痕20 μL，每日 1 次，共 5 次。隨機(jī)分為 4 組(A，B，C，D 組)，各4只兔(48個(gè)瘢痕)。實(shí)驗(yàn)組(以生藥鹽酸川芎嗪的質(zhì)量濃度為基準(zhǔn)）中B組給予質(zhì)量低濃度丹參川芎嗪組(100mg／L)，C 組給予中質(zhì)量濃度丹參川芎嗪(200mg／L)，D組給予高質(zhì)量濃度丹參川芎嗪(400 mg／L)；對(duì)照組(A組)給予相同容積的生理鹽水。

取材方式與處理：于術(shù)后第4周，每組隨機(jī)處死2只白兔，切取標(biāo)本。按1.2.1項(xiàng)下麻醉方式并消毒，切口沿瘢痕邊緣位于兔耳正常皮膚與瘢痕交界處，垂直于皮膚表面，深達(dá)軟骨表面，整個(gè)瘢痕組織完整切取。將每個(gè)瘢痕平均分成2份，1份用4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水，透明，包埋，切片，然后分別進(jìn)行HE染色及PCNA免疫組織化學(xué)染色;1份用液氮快速冷凍，后轉(zhuǎn)為低溫冰箱-80℃保存，氯胺-T法測(cè)定羥脯氨酸(HPr)含量。其余繼續(xù)喂養(yǎng)，術(shù)后56 d，同樣在麻醉?xiàng)l件下處死每組最后2只白兔，切取瘢痕組織標(biāo)本。

1.2.3 觀察指標(biāo)與方法

瘢痕厚度測(cè)定：術(shù)后32，56 d用彩色超聲診斷儀(探頭超聲頻率為13 MHz)，同一測(cè)定人在相同條件下測(cè)定各組創(chuàng)面形成瘢痕的厚度。

瘢痕組織HE染色：瘢痕組織標(biāo)本用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)5 mm厚度切片，常規(guī)爬片。HE染色，觀察增生性瘢痕的病理表現(xiàn)。

PCNA免疫組化：于光鏡下觀察陽(yáng)性信號(hào)，陽(yáng)性信號(hào)為黃色。在400倍光鏡下觀察結(jié)果，在每張切片的上、中、下、左、右找5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)，陽(yáng)性細(xì)胞反應(yīng)率(R)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)／細(xì)胞總數(shù)，結(jié)果取均數(shù)。

HPr含量測(cè)定[9-10]：標(biāo)準(zhǔn)管中加入 10 μg ／mL 的L-HPr，空白管調(diào)零。計(jì)算最終結(jié)果：每 1 g組織中HPr含量(mg／g)=測(cè)量管光度值÷標(biāo)準(zhǔn)管光度值×10(μg／mL)÷100÷標(biāo)本質(zhì)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用配對(duì)設(shè)計(jì)的 t檢驗(yàn)、單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瘢痕組織學(xué)觀察結(jié)果

術(shù)后32 d和56 d，實(shí)驗(yàn)組瘢痕面積變小，高度變低，質(zhì)地變軟，與對(duì)照組比較，差異顯著。在HE染色法切片上，對(duì)照組瘢痕組織內(nèi)大量成纖維細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和毛細(xì)血管可見膠原纖維呈環(huán)形或螺旋樣排列，組織內(nèi)少量炎性細(xì)胞；實(shí)驗(yàn)組瘢痕組織內(nèi)成纖維細(xì)胞明顯少于對(duì)照組，膠原纖維及成纖維細(xì)胞排列較整齊，細(xì)胞外基質(zhì)多，毛細(xì)血管減少。在術(shù)后56 d，實(shí)驗(yàn)組兔耳瘢痕組織較術(shù)后32 d真皮層更薄，膠原及成纖維細(xì)胞排列更整齊。HE染色結(jié)果見圖1。

2.2 瘢痕厚度測(cè)定

術(shù)后32 d和56 d，A組瘢痕組織厚度明顯高于B，C，D組，而B組又高于C，D組，C組高于D組。結(jié)果見表1。

2.3 PCNA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

術(shù)后32 d和56 d，A組兔耳瘢痕組織PCNA表達(dá)明顯，黃色為陽(yáng)性表達(dá)，D組PCNA表達(dá)明顯下降。術(shù)后32，56 d，實(shí)驗(yàn)組PCNA較對(duì)照組標(biāo)的均有明顯下降。詳見表1。PCNA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果見圖2。

2.4 HPr含量測(cè)定

在術(shù)后32 d和56 d的瘢痕組織中，HPr含量測(cè)定結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組明顯下降。結(jié)果見表1。

表1 各組兔耳瘢痕增生指數(shù)、PCNA陽(yáng)性表達(dá)率和HPr含量比較（±s，mm，n=24）

表1 各組兔耳瘢痕增生指數(shù)、PCNA陽(yáng)性表達(dá)率和HPr含量比較（±s，mm，n=24）

注：與 A 組同時(shí)點(diǎn)比較，#P ＜0.01；與本組 32 d時(shí)比較，bP ＜0.01。

組別 瘢痕增生指數(shù) P C N A陽(yáng)性表達(dá)率 H P r含量(m g／g)A組B組C組D組3 2 d 3.1 2 7 ± 0.2 3 5 2.8 2 9 ± 0.1 9 3#2.4 3 8 ± 0.1 6 5#1.8 5 2 ± 0.1 8 3#5 6 d 3.0 1 5 ± 0.2 2 7 2.6 7 5 ± 0.1 8 5#b 2.3 7 3 ± 0.1 5 4#b 1.7 3 9 ± 0.1 9 2#b 3 2 d 6 8.7 ± 8.3 5 3.2 ± 6.5#4 6.5 ± 5.4#3 2.4 ± 3.9#5 6 d 5 4.9 ± 7.8 4 2.5 ± 5.4#b 3 5.7 ± 4.2#b 2 6.2 ± 3.8#b 3 2 d 1 6.5 8 3 ± 0.2 1 5 1 4.3 2 7 ± 0.1 9 4#1 3.2 5 3 ± 0.1 6 9#1 1.5 8 4 ± 0.1 7 3#5 6 d 1 5.8 6 9 ± 0.2 0 3 1 3.5 1 6 ± 0.1 8 4#b 1 2.7 2 3 ± 0.1 7 9#b 1 0.6 9 4 ± 0.1 8 2#b

圖1 術(shù)后32 d兩組瘢痕組織化學(xué)染色結(jié)果（HE×400）

圖2 術(shù)后32 d兩組PCNA免疫組織化學(xué)染色結(jié)果（SP×400）

3 討論

增生性瘢痕是整形外科基礎(chǔ)研究的重要課題之一，嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷及外科手術(shù)后常常遺留增生性瘢痕，影響外觀和功能，但一直都缺乏理想的治療方法。近年研究結(jié)果顯示，越來(lái)越多的學(xué)者從中醫(yī)中藥中篩選出療效確切、不良反應(yīng)小的藥物來(lái)抗疤痕纖維化，其中丹參川芎嗪注射液是中藥丹參及川芎嗪按科學(xué)配方提取的復(fù)方注射液。研究證實(shí)，川芎嗪為一種新型鈣離子拮抗藥，可通過(guò)直接清除氧自由基、抗脂質(zhì)過(guò)氧化、抑制成纖維細(xì)胞分裂和增殖，從而起到抗組織損傷和防治肺纖維化的作用[11]；通過(guò)抑制肝脂質(zhì)過(guò)氧化、抑制星狀細(xì)胞活化增殖、降低膠原合成等途徑改善肝功能[12-13]。

本研究中采用局部注射丹參川芎嗪對(duì)兔耳瘢痕進(jìn)行治療，為避免注射不同濃度或?qū)φ账幬锍霈F(xiàn)相互影響，造模、隨機(jī)分組后行局部藥物干預(yù)，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中瘢痕組織厚度、硬度與藥物濃度呈負(fù)相關(guān)，實(shí)驗(yàn)組瘢痕組織中PCNA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和HPr含量明顯減少，呈劑量效應(yīng)關(guān)系；與對(duì)照組比較，其表達(dá)呈顯著性降低；不同時(shí)間點(diǎn)(術(shù)后32 d和56 d)取材的同濃度實(shí)驗(yàn)組間相比，術(shù)后56 d的PCNA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和HPr含量較術(shù)后32 d明顯減少。表明丹參川芎嗪可以明顯抑制PCNA蛋白陽(yáng)性表達(dá)率和HPr的生成，進(jìn)而抑制成纖維細(xì)胞的增殖，減少膠原的合成。HE染色結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組中成纖維細(xì)胞明顯少于對(duì)照組，表皮層增厚，成纖維細(xì)胞排列較規(guī)則，細(xì)胞外基質(zhì)多，可見少量毛細(xì)血管。說(shuō)明丹參川芎嗪通過(guò)抑制成纖維細(xì)胞的增殖，可起到減輕瘢痕形成的作用，其療效與藥物濃度在一定范圍內(nèi)成正比。這與商慶新等[14]的研究結(jié)果一致。丹參川芎嗪為中藥丹參素和川芎嗪的衍生合成制劑，其藥理作用強(qiáng)，不良反應(yīng)小。進(jìn)一步研究其藥理活性，可望開發(fā)出高效、低毒、價(jià)廉的抗瘢痕新藥，有望通過(guò)改變藥物的劑型，增加藥物皮膚的滲透性，從而成為預(yù)防和治療人皮膚增生性瘢痕的有效藥物。

[1]高明月，藺 潔，張文顯.增生性瘢痕的防治現(xiàn)狀與展望[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14(20)：3753-3756.

[2]李薈元，魯開化，郭淑忠.新編瘢痕學(xué) [M].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2003：28-79.

[3]孫廣富，李作任，蔣云祥.丹芎瘢痕涂膜預(yù)防和治療深Ⅱ度燒傷后瘢痕增生的療效觀察[J].臨床軍醫(yī)雜志，2005，33(4)：509-510.

[4]趙連魁，谷廷敏，劉建春，等.維芎瘢痕霜對(duì)增生性瘢痕影響的臨床研究[J].中國(guó)實(shí)用美容整形外科雜志，2004，15(5)：249-250.

[5]王世龍，林 原，唐澤耀.川芎嗪在各類神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的保護(hù)作用及其機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26（4）：438-440.

[6]Morris DE，Wu L，Zhao LL，et al.Acute and chronic animal modelsfor excessive dermal scarring：quantitative[J].Hast Reconstr surg，1997，100(3)：674-681.

[7]李薈元，劉建波，蘭 海.建立增生性瘢痕動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998 ，19(6)：655-657.

[8]李薈元.創(chuàng)傷研究動(dòng)物模型——兔耳瘢痕模型的建立與應(yīng)用[M].西安：第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2005：42-43，74-76.

[9]李希軍，柳大烈，張 陽(yáng).透明質(zhì)酸及透明質(zhì)酸酶對(duì)兔耳創(chuàng)面增生性瘢痕形成影響的對(duì)比研究[J].中華醫(yī)學(xué)美學(xué)美容雜志，2001，7(4)：194-197.

[10]舒 彬，郝林林，吳宗耀，等.兔耳增生性瘢痕的形態(tài)學(xué)觀察與羥脯氨酸含量變化[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，23(3)：343-345.

[11]陳 爽，張 艷，李孝生.川芎嗪對(duì)大鼠肝纖維化轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 1、Smad2／3表達(dá)的影響[J].胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2013，22(10)：970-973.

[12]Gu Y，Liang Z，Wang H，et al.Tanshinone IIA protects H9c2 cellsfrom oxidative stress-induced cell death via microRNA-133 upregulation and Akt activation[J].Exp Ther Med，2016，12(2)：1147-1152.

[13]Jing X，Xu Y，Cheng W，et al.Tanshinone I induces apoptosis and prosurvival autophagy in gastric cancers[J].Cancer Chemother Pharmacol，2016，77(6)：1171-1181.

[14]商慶新，張滌生，關(guān)文祥，等.丹參和川芎嗪注射液對(duì)瘢痕成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的體外抑制實(shí)驗(yàn)[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，1998，12(6)：321-324.