穿心蓮內(nèi)酯對糖尿病腎病小鼠的治療作用及機(jī)制

李夢詩，吳 騰，曹靜樺，何亞軍，亓翠玲，王麗京

(廣東藥科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院血管生物學(xué)研究所，廣州 510006)

糖尿病是常見的內(nèi)分泌疾病，在全球流行性疾病中僅次于心腦血管疾病、腫瘤、艾滋病位列第4，嚴(yán)重威脅著人類健康[1]。糖尿病腎病是糖尿病最常見的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎病的重要因素，最終導(dǎo)致腎衰竭[2]。腎小球系膜細(xì)胞是腎小球的主要功能細(xì)胞，無論是在腎臟的生理功能或是病理變化中都發(fā)揮著重要作用。由腎小球系膜細(xì)胞的過度增生及細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過度積累所導(dǎo)致的腎小球硬化是糖尿病腎病的主要病理特點(diǎn)，通常伴有蛋白尿和腎小球?yàn)V過率下降等臨床表現(xiàn)[3-6]。纖維粘連蛋白(fibronectin,FN)是ECM的主要成分，是評價ECM累積的重要指標(biāo)[7]。有研究報(bào)道糖尿病患者機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激水平有升高的趨勢，可以在糖尿病腎病患者腎臟中檢測到活性氧化物質(zhì)(reactive oxygen species,ROS)增高。有研究提示，在糖尿病動物模型中，通過抑制腎臟ROS水平可有效改善腎小球和腎小管的病理性改變[8]。亦有研究表明,NAPDH氧化酶4(NOX-4)是腎臟細(xì)胞ROS產(chǎn)生的主要途徑之一[9-13]。

穿心蓮屬爵床科穿心蓮屬植物，其主要有效成分為穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide，Andro)，是一種二環(huán)雙萜內(nèi)酯類化合物。中醫(yī)認(rèn)為穿心蓮屬于寒性藥物，有消熱排毒的療效。近年研究表明Andro具有抗炎的作用，并對動脈粥樣硬化、高血壓及腫瘤有一定療效及抑制作用[14-16]。此外。Andro還被發(fā)現(xiàn)能夠在1型糖尿病中發(fā)揮保護(hù)胰島β細(xì)胞的功能及減緩NOD小鼠自發(fā)免疫性糖尿病的病理進(jìn)程[17-18]。另外，也有研究證實(shí)Andro能通過減少細(xì)胞ROS產(chǎn)生，從而在體內(nèi)/體外達(dá)到治療與氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的目的[19-21]。目前，Andro對糖尿病腎病的作用尚未見報(bào)道，本研究利用自發(fā)糖尿病轉(zhuǎn)基因Leprdb/db小鼠，研究Andro對Leprdb/db小鼠糖尿病腎病的作用及其機(jī)制。

1 材 料

1.1 試 劑

穿心蓮內(nèi)酯粉末(美國Sigma公司)溶解于DMSO中，配成質(zhì)量濃度為200 mg/mL的溶液，使用時蒸餾水稀釋1000倍；24 h尿蛋白檢測試劑盒、肌酐檢測試劑盒和尿素氮檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；蘇木精染液、小鼠及兔二抗、DAB顯色試劑(北京中杉金橋生物有限公司)；BSA[生工生物工程(上海)股份有限公司]，4%多聚甲醛溶液(博士德生物工程有限公司)。

1.2 儀 器

PR-MBJ-1全自動生物組織包埋機(jī)(PR公司)；石蠟切片機(jī)(德國Leica公司)；獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠具IVC與小鼠代謝籠(蘇杭科技器材有限公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；冷凍高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio Tek公司)。

1.3 動 物

轉(zhuǎn)基因小鼠Leprdb/db小鼠購自南京大學(xué)模式動物研究所(Jackson實(shí)驗(yàn)室貨號000642)，C57BL/6小鼠購自廣東省動物中心，許可證號：SCXK(粵)2013-0002。小鼠自購買后均飼養(yǎng)于SPF級實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境中，光照時間為12 h/12 h晝夜交替。所有動物實(shí)驗(yàn)均符合動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 小鼠分組及給藥

選用18周齡體重在42～48 g的雄性Leprdb/db小鼠，剪指做好標(biāo)記，將小鼠隨機(jī)分為兩組，一組每兩天腹腔注射1 μg/g Andro至26周[7]，另一組則注射DMSO溶解的相同體積的生理鹽水至26周，另外，選用同樣周齡的體重在28～32 g雄性C57BL/6小鼠作為陰性對照組。每組各7只。

2.2 肌酐、尿素氮，尿蛋白含量的測定

治療8周后，將小鼠置于代謝籠中24 h，從收集尿液的瓶子中取出尿樣，進(jìn)行尿蛋白和尿素氮的檢測。將小鼠眼眶取血，4 000 r/min離心取上清液，檢測血清中的肌酐水平。

用AU800全自動生化分析儀檢測血肌酐、尿素氮。其中血肌酐采用苦味酸法，尿素氮采用脲酶法。

24 h尿蛋白定量：采用考馬斯亮藍(lán)法檢測實(shí)驗(yàn)小鼠24 h尿蛋白含量。

2.3 蘇木精-伊紅(HE)染色

石蠟切片梯度脫蠟，水化，蘇木精染色1分30秒，流水返藍(lán)1 h，伊紅染色15秒，流水沖洗3遍，脫水透明，中性樹脂封片。

2.4 過碘酸-希夫(PAS)染色

石蠟切片梯度脫蠟至水，蒸餾水洗1～2 min，過碘酸溶液氧化10 min，流水洗10 min，希夫(Schiff)試劑染色10 min，流水洗5 min，蘇木精染核2 min，流水沖洗10 min，常規(guī)脫水、透明、封片。

2.5 免疫組化

石蠟切片脫蠟后，用PBS洗3次，每次5 min。高壓修復(fù)5 min。PBS洗后，用3%過氧化氫-甲醇37 ℃孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min，10%BSA封閉。一抗(1%BSA稀釋1∶100)4 ℃冰箱孵育過夜。第2天，復(fù)溫后，PBS洗，37 ℃烘箱孵育相應(yīng)二抗(1%BSA稀釋1∶100)40 min。DAB顯色，蘇木精染核后，脫水、透明、封片。

PAS染色及免疫組化染色，由Image-Pro Plus統(tǒng)計(jì)積分光密度(integrated optical density，IOD)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 Andro對Leprdb/db小鼠的24 h尿蛋白、血肌酐和血尿素氮水平的影響

用Andro治療Leprdb/db小鼠，隨機(jī)分為兩組，一組每2天腹腔注射1 μg/g Andro至26周，另一組則注射相同體積DMSO溶解的的生理鹽水。治療后發(fā)現(xiàn)Andro治療組的24 h尿蛋白(P<0.001)、血肌酐(P<0.05)和血尿素氮(P<0.01)水平比對照組明顯降低(圖1)。

3.2 Andro對Leprdb/db小鼠腎小球病理性變化的影響

治療結(jié)束后取材，石蠟包埋，切片HE染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Andro實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，治療組腎小囊結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常，腎小球細(xì)胞的細(xì)胞核排列規(guī)則，提示Andro能顯著改善Leprdb/db小鼠腎小球系膜的擴(kuò)張(圖2-A)。

此外，為檢測小鼠腎臟中的還原糖水平，對這3種小鼠的切片進(jìn)行PAS染色(圖2-B)。發(fā)現(xiàn)Andro 治療后，Leprdb/db小鼠腎臟著色比對照組明顯減輕(P<0.05)，與正常C57BL/6小鼠水平相近，表明Andro可以減輕腎臟還原糖累積。因此，Andro 能夠改善Leprdb/db小鼠在形態(tài)學(xué)上的腎損傷，同時也能減輕Leprdb/db小鼠整個腎臟的還原糖水平(圖2-B、2-C)。

A:Albuminuria levels；B:Serum creatinine；C:Blood urea nitrogen levels

*P<0.05,*P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1

Figure2 Andrographolide ameliorates glomerular pathological changes in Leprdb/dbmice

3.3 Andro對Leprdb/db小鼠腎臟中FN表達(dá)的影響

FN是ECM的主要成分，ECM的累積與糖尿病腎病的發(fā)展密切相關(guān)。本研究用免疫組化進(jìn)行FN染色(圖3)，發(fā)現(xiàn)DMSO組Leprdb/db小鼠腎FN的水平明顯高于正常對照組小鼠(P<0.000 1)，而Andro治療減少Leprdb/db小鼠腎臟中FN表達(dá)水平(P<0.001)。上述結(jié)果證明Andro可以通過減少Leprdb/db小鼠腎臟中FN的積累進(jìn)而改善糖尿病腎病。

Figure3 Effect of Andro on fibronectin (FN) expression in Leprdb/dbmice kidney

3.4 Andro對Leprdb/db小鼠腎小球NOX-4水平的影響

相比C57BL/6小鼠，NOX-4在Leprdb/db小鼠腎小球系膜中的大量表達(dá)，Andro治療減少了小鼠腎臟中NOX-4的表達(dá)水平(P<0.01)。上述結(jié)果提示，Andro可能是通過減少Leprdb/db小鼠細(xì)胞NOX-4的表達(dá)水平，進(jìn)而改善糖尿病腎病中的氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而改善糖尿病腎病。

Figure4 Effect of Andro on NOX-4 expression in Leprdb/dbmice kidney

4 討 論

糖尿病腎病是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，在我國的發(fā)病率亦呈上升趨勢。20%～40%的糖尿病患者會并發(fā)糖尿病腎病，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制尚未明確，可以通過測量血尿素氮、血清肌酐、肌酐清除率和蛋白尿來診斷糖尿病腎病[22]。目前，糖尿病腎病臨床常用藥一般分為降糖類藥物和非降糖類藥物。常用的治療糖尿病腎病的中成藥有腎康注射液、黃芪注射液等[23]。黃芪注射液可以降低腎臟蛋白的排泄，具有保護(hù)腎臟的功能[24]。

Andro具有抗炎、抗腫瘤及治療動脈粥樣硬化等的作用，近年來，研究發(fā)現(xiàn)Andro能夠改善自發(fā)免疫性糖尿病NOD小鼠的糖尿病病理進(jìn)程[17-18]。Lan等[25]也報(bào)道Andro可以顯著降低高糖誘導(dǎo)MCs細(xì)胞增殖和FN的表達(dá)，但是Andro對自發(fā)糖尿病Leprdb/db小鼠糖尿病腎病的作用尚未見研究。Leprdb/db小鼠是由美國Jackson實(shí)驗(yàn)室于1966年在C57BLKS/J(BKS)近交系中發(fā)現(xiàn)糖尿病突變基因(db)，是位于小鼠4號染色體的瘦素受體(leptin receptor)基因發(fā)生突變所致[26]。因其多飲、多食、多尿、肥胖、高血糖、高胰島素血癥等癥狀與人類2型糖尿病患者的臨床癥狀相似，因此被廣泛應(yīng)用于糖尿病及其并發(fā)癥等疾病的研究中。

本研究利用Leprdb/db小鼠研究了Andro對糖尿病腎病的作用。發(fā)現(xiàn)Andro可以顯著降低Leprdb/db小鼠24 h尿蛋白、尿肌酐和血尿素氮的水平,顯著改善了Leprdb/db小鼠腎臟代謝相關(guān)的生化指標(biāo)代謝水平。另外，本研究通過觀察Leprdb/db小鼠腎臟組織形態(tài)，發(fā)現(xiàn)Andro治療對Leprdb/db小鼠的腎小球病理性改變有明顯的改善作用，并且可以減少其腎臟的還原糖水平和ECM的累積。近年來，越來越多的研究表明，氧化應(yīng)激在糖尿病腎病的發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著不可忽視的作用[27]。為此，本研究進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Andro可能通過降低Leprdb/db小鼠腎臟中NOX-4表達(dá)水平以抑制腎臟細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，進(jìn)而緩解了Leprdb/db小鼠糖尿病腎病的病情。然而，Andro對Leprdb/db小鼠糖尿病腎病的具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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