頂空氣相色譜法測定selexipag中6種有機溶劑殘留量

李麗麗，王洪朋，田海偉，李 晉，高雙雙，哈 婧

(河北科技大學化學與制藥工程學院，石家莊 050018)

肺動脈高壓是以血管增殖、重塑、原位血栓形成、肺血管床進行性閉塞和肺血管阻力進行性增加為特征的肺小動脈疾病。Selexipag是由日本新藥株式會社和愛可泰隆醫(yī)藥公司聯(lián)合開發(fā)的一種前列環(huán)素受體(PGI2)激動劑[1]。該藥于2015年12月21日獲美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準上市，又于2016年5月12日獲歐洲藥品管理局(EMA)批準上市，用于治療肺動脈高壓。Selexipag化學名為2-{4-[(5,6-二苯基吡嗪-2-基)(異丙基)氨基]丁氧基}-N-(甲基磺酰基)乙酰胺，藥理作用為舒緩血管壁平滑肌從而擴張血管，增加肺部供血[2]。Selexipag及其活性代謝產(chǎn)物對IP-受體的選擇性優(yōu)于其他前列腺素受體，被FDA授予孤兒藥地位[3]。其結(jié)構(gòu)式見圖1。

Figure1 Chemical structure of selexipag

Selexipag在合成過程中使用了6種溶劑[4-5]，其中4種第二類溶劑(甲醇、二氯甲烷、四氫呋喃、甲苯)，2種第三類溶劑(乙醇、丙酮)。目前尚未見有關(guān)selexipag原料藥殘留溶劑的檢測方法報道，為有效控制產(chǎn)品質(zhì)量、保證用藥安全，本研究參考人用藥物注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(ICH)的有機溶劑殘留量研究指導(dǎo)原則和《中華人民共和國藥典》(2015年版)四部通則[6]，采用頂空毛細管氣相色譜法[7-10]對selexipag原料藥中6種殘留溶劑進行測定，建立了selexipag原料藥中甲醇、乙醇、丙酮、二氯甲烷、四氫呋喃和甲苯頂空氣相色譜測定方法，并進行了方法學驗證[11]，結(jié)果表明，該方法分離度好，精密度高、加樣回收率結(jié)果滿意，適用于selexipag原料藥中6種殘留溶劑的測定，并為保證用藥安全，進一步控制3類有機溶劑的殘留量提供了科學依據(jù)。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

Selexipag原料藥為河北省藥用分子重點實驗室自制，批號分別為20160813、20160911、20160918。其他試劑均為分析純。

1.2 儀 器

GC7900氣相色譜儀(中國天美科學儀器有限公司)；DK3001A頂空進樣器(中國北京中興分析儀器新技術(shù)研究所)；GH-30高純氫發(fā)生器、GA-2000A 低噪音空氣泵(中國北京中興匯利科技發(fā)展有限公司)；AL204萬分之一電子天平(瑞士Mettler公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及測定方法

色譜柱為Kromat PC-624(V)毛細管柱(固定相為6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷，30.0 m×0.32 mm,1.8 μm)；進樣口溫度:200 ℃，檢測器溫度:250 ℃；柱溫：初始溫度為40 ℃，保持5 min，以20 ℃/min的速率升溫至180 ℃，保持5 min；載氣：高純氮氣；進樣方式:頂空進樣，定量環(huán)1 mL；平衡溫度:80 ℃，平衡時間:30 min；閥箱溫度:100 ℃，傳輸線溫度:110 ℃。

精密量取對照品溶液或供試品溶液5 mL，密封于20 mL頂空瓶中，經(jīng)頂空平衡后，量取其頂端氣體，注入氣相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積來計算各殘留溶劑的含量。

2.2 溶液制備

2.2.1 混合對照品溶液制備 稱取甲醇約1.5 g、無水乙醇約2.5 g、二氯甲烷約0.3 g、四氫呋喃約0.36 g、丙酮約2.5 g、甲苯約0.5 g，精密稱定，各置50 mL量瓶中用二甲基亞砜溶解定容；精密量取上述溶液各1 mL置10 mL量瓶中用二甲基亞砜定容至刻度，作為混合對照品儲備液。精密吸取上述對照品儲備液0.4 mL置10 mL量瓶中用二甲基亞砜定容至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液制備 取selexipag原料藥約0.2 g，精密稱定，置20 mL頂空瓶中，精密加入二甲基亞砜5 mL使樣品溶解，搖勻，密封，即得。

2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

取空白溶劑二甲基亞砜、混合對照品溶液、供試品溶液，按“2.1”項色譜條件及進樣方法進行分析，結(jié)果表明空白溶劑無干擾，限度混合對照品溶液中各色譜峰的理論塔板數(shù)均大于5 000，各相鄰峰的分離度大于1.5，色譜圖見圖2。

2.4 線性關(guān)系考察

精密量取混合對照品儲備液1，3，5，7，10 mL分別置于100 mL量瓶中，加二甲基亞砜稀釋至刻度，搖勻，作為系列標準線性溶液，分別精密量取5 mL 置20 mL頂空進樣瓶中，密封，搖勻，按“2.1”項色譜條件及進樣方法進行分析，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，進行線性回歸，結(jié)果見表1。

Figure2 HPLC of blank solution(A)，mixed solvent(B)and selexipag test solution(C)

1：Methanol;2：Ethanol;3：Acetone;4：Dichloromethane;5：Tetrahydrofuran;6：Toluene;7：Dimethy-lsulfoxide

Table1 Results of linearity test for the mixed solvent

SolventLinearequationrLinearrange/(μg/mL)MethanolY=2074X+0041210003207?3201EthanolY=2599X-0065610005010?5010AcetoneY=1698X-361610005164?5164DichloromethaneY=03131X-05616099826080?6076TetrahydrofuranY=2162X-3276099917590?7588TolueneY=1431X-2858099861076?1076

2.5 精密度試驗

精密量取混合對照品溶液5.0 mL，分別置于20 mL頂空瓶中，平行制備6份作為精密度試驗溶液，按“2.1”項色譜條件及進樣方法進行分析，計算各被測組分甲醇、乙醇、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃、甲苯峰面積的RSD(%，n=6)，分別為2.9，3.0，3.2，2.4，2.5和3.1，表明色譜系統(tǒng)精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

取selexipag原料藥(批號20160813)約0.2 g，按“2.2.2”項配制供試品溶液6份，按“2.1”項色譜條件及進樣方法進行分析，記錄色譜圖按外標法進行計算。結(jié)果甲醇、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃、甲苯均未被檢出，乙醇的平均含量為0.3%，RSD為2.0%(n=6)，表明系統(tǒng)重復(fù)性良好。

2.7 供試品穩(wěn)定性試驗

取selexipag原料藥(批號20160813)約0.2 g，按“2.2”項配制供試品溶液5份，按“2.1”項色譜條件及進樣方法進行分析，考察樣品溶液8 h之內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果甲醇、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃、甲苯均未被檢出，乙醇的平均含量為0.3%，RSD為1.7%(n=5)，表明樣品在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 檢出限與定量限

取各對照品儲備液，用二甲基亞砜逐級稀釋，按“2.1”項色譜條件及進樣方法進行分析，以信噪比S/N=10為定量限，甲醇、乙醇、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃、甲苯定量限(μg/mL)分別為16.0，25.15，28.82，3.03，28.45，26.90。以信噪比S/N=3為檢測限(μg/mL)分別為1.60，2.50，2.58，1.51，5.69，5.38。

2.9 定量限精密度試驗

分別精密量取甲醇、乙醇、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃、甲苯定量限溶液，按“2.1”項色譜條件及進樣方法進行分析，計算甲醇、乙醇、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃、甲苯定量限峰面積的RSD(%，n=3)，分別為2.5，1.9，2.2，3.4，2.8和3.5，表明定量限精密度良好。

2.10 準確度試驗

精密量取對照品儲備液0.32，0.40，0.48 mL置于10 mL量瓶中加入二甲基亞砜定容至刻度。精密稱取20160813批樣品約0.2 g，共9份，分別精密加入上述試液5 mL，每個濃度平行3份，密封、搖勻，按“2.1”項色譜條件及進樣方法進行分析，記錄色譜圖，按外標法進行計算，結(jié)果見表2。

2.11 樣品測定

取selexipag原料藥3批(批號分別為20160813、20160911、20160918)，按“2.2.2”項制備供試品溶液，每批2份按“2.1”項色譜條件及進樣方法進行分析，按外標法計算3批樣品中乙醇的含量分別為0.3%，0.3%，0.4%，甲醇、二氯甲烷、丙酮、四氫呋喃、甲苯均未被檢出。

Table2 Recovery of six residual solvents of selexipag(n=9)

SolventAveragerecovery/%RSD/%Methanol9967249Ethanol9872324Acetone10167249Dichloromethane9864136Tetrahydrofuran9784146Toluene9857164

3 討 論

3.1 進樣方式選擇

Selexipag采取直接進樣模式時，甲醇色譜峰拖尾嚴重，與乙醇分離度較差，而且由于樣品質(zhì)量濃度較大，直接進樣易造成色譜柱污染，所以采取頂空進樣方式。

3.2 溶劑的選擇

Selexipag水溶性較差，不能用水作溶劑直接進樣，N，N-二甲基甲酰胺作溶劑時各溶劑峰之間分離度不理想；而用二甲基亞砜作溶劑時對待測的6種溶劑無干擾回收率好，各溶劑峰形較好，最終選擇二甲基亞砜作為試驗溶劑。

3.3 頂空平衡溫度的選擇

固定頂空平衡時間30 min，考察平衡溫度分別為80，90，100 ℃時各待測溶劑的色譜峰面積的變化。隨著平衡溫度的提高，色譜峰面積沒有明顯增高的趨勢，考慮到溫度過高會使藥物分解影響分析結(jié)果，且待測溶劑均可在80 ℃條件下全部檢出，故將平衡溫度設(shè)為80 ℃。

3.4 頂空平衡時間的選擇

固定平衡溫度80 ℃，分別考察平衡時間為20，30，40 min，各待測溶劑的色譜峰面積的變化結(jié)果表明，平衡時間為30和40 min時，待測組分峰面積明顯高于20 min，但30 min和40 min平衡時間測定的待測溶劑峰面積沒有明顯差異，故將平衡時間設(shè)為30 min。

3.5 頂空進樣瓶中溶劑體積的選擇

頂空瓶中分別加入溶劑3，4，5 mL，考察峰面積變化情況，結(jié)果表明加入5 mL溶劑時峰面積明顯高于3 mL，4 mL。因考慮到氣液平衡及進樣針的位置問題并沒有繼續(xù)考察加大溶劑量的情況，最終選擇5 mL作為進樣瓶中的溶劑體積。

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