干細(xì)胞來源外泌體在心肌梗死后心臟修復(fù)的研究進(jìn)展

趙永超，石蓓

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000)

我國步入老年化社會(huì)，缺血性心肌病發(fā)病率及病死率居高不下，目前臨床上治療手段主要有藥物治療、支架置入術(shù)、冠脈搭橋等，然而這些傳統(tǒng)技術(shù)僅能挽救瀕危的心肌細(xì)胞，并不能使梗死的心肌細(xì)胞再生。胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞以及骨髓源性干細(xì)胞在臨床上的應(yīng)用為缺血性心肌病患者帶來曙光。干細(xì)胞具有多向分化特性，可通過分化為特定細(xì)胞譜系的特異組織發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。目前研究較多的干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞[1]、多能干細(xì)胞[2]、成體干細(xì)胞[1,3]三大類，而成體干細(xì)胞根據(jù)組織來源又可細(xì)分為間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)、內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)、心臟祖/干細(xì)胞(CPCs/CSCs)。迄今為止，因?yàn)槌审w干細(xì)胞提取自自體組織，所以具有倫理壓力及免疫排斥較小、易于分離提取等優(yōu)勢(shì)，使得成體干細(xì)胞廣泛應(yīng)用于心肌梗死后心臟再生治療。干細(xì)胞治療雖然能明顯改善心肌梗死后心臟功能，但是其具有致畸作用、排斥反應(yīng)等危險(xiǎn)，并且干細(xì)胞獲取困難、移植細(xì)胞定植率低、難以增殖分化等困難，使得干細(xì)胞臨床應(yīng)用受限。至今，越來越多的實(shí)驗(yàn)及臨床研究提示[2, 4]，干細(xì)胞移植后主要通過旁分泌途徑分泌外泌體作用于受損區(qū)域的內(nèi)源性成體CSCs/心肌細(xì)胞，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡、抗纖維化形成、促進(jìn)血管新生、促進(jìn)心肌細(xì)胞分化進(jìn)而改善心功能。

1 外泌體的生物學(xué)特征

既往人們認(rèn)為外泌體是細(xì)胞排泄廢物的重要機(jī)制之一，然而近年研究表明，外泌體是細(xì)胞與細(xì)胞之間進(jìn)行信息交流的重要媒介物質(zhì)。外泌體[5]是一類由哺乳動(dòng)物細(xì)胞通過旁分泌方式分泌的天然的內(nèi)源性納米級(jí)囊泡(直徑30～100 nm)，可通過超速離心法或試劑盒法等多種方法從細(xì)胞條件培養(yǎng)基及多種體液(如血液、唾液、汗液、淚液、精液、尿液等)中分離提取。外泌體由細(xì)胞芽生而成，其質(zhì)膜上會(huì)表達(dá)一些保守蛋白，如跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81等)，此外根據(jù)細(xì)胞的不同來源外泌體膜上還可能攜帶某些細(xì)胞特異性膜蛋白，如MSCs來源的外泌體可能攜帶CD29分子。外泌體可攜帶多種信息成分，包括蛋白質(zhì)因子、脂質(zhì)體、基因片段、非編碼RNA等，需要特別提出的是，其分子成分與水平變化隨來源細(xì)胞類型、大小、分化階段及其所處微環(huán)境的不同而存在差異。外泌體通過抗體配體配對(duì)機(jī)制被靶細(xì)胞識(shí)別、內(nèi)化或以質(zhì)膜融合方式，將其攜帶的遺傳信息分子傳遞給靶細(xì)胞，影響其生物學(xué)進(jìn)程。

2 干細(xì)胞非細(xì)胞治療

干細(xì)胞治療逐漸被批準(zhǔn)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)，目前發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞治療能夠明顯改善心肌梗死后心臟功能，但也面臨諸多問題與輿論壓力，例如干細(xì)胞移植具有致畸作用、排斥反應(yīng)等危害，并且面臨惡劣微環(huán)境的移植細(xì)胞定植率低、存活率低等難題。

Lai等[6]首次將人胚胎干細(xì)胞來源的MSCs條件培養(yǎng)液注射至急性心肌梗死動(dòng)物模型中，發(fā)現(xiàn)可顯著改善心肌梗死后后心臟功能且心肌梗死面積明顯減小，這說明了干細(xì)胞治療缺血性心肌病可能并非通過干細(xì)胞的遷移、增殖、分化過程起作用，而是通過分泌某些效應(yīng)分子影響心肌梗死區(qū)域內(nèi)源性細(xì)胞起心臟修復(fù)作用。為進(jìn)一步探討其潛在機(jī)制，該團(tuán)隊(duì)從培養(yǎng)液中提取出一種膜性囊泡并對(duì)其進(jìn)行鑒定，最后將其命名為外泌體。該項(xiàng)研究為心肌梗死后干細(xì)胞的非細(xì)胞治療策略奠定了重要的理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

隨后越來越多干細(xì)胞研究學(xué)者將眼光移向外泌體，研究發(fā)現(xiàn)多種干細(xì)胞、成熟細(xì)胞都具有旁分泌外泌體特性，且外泌體很可能是細(xì)胞與細(xì)胞間傳遞信號(hào)的載體。心肌細(xì)胞面臨應(yīng)激環(huán)境可分泌含特定遺傳信息的外泌體，干細(xì)胞將外泌體內(nèi)化后誘導(dǎo)其表型定向重組以適應(yīng)應(yīng)激；而干細(xì)胞也可分泌外泌體，致?lián)p傷心肌細(xì)胞中抗凋亡基因上調(diào)、促凋亡基因下調(diào)，從而抑制損傷心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖及心肌梗死區(qū)域血管新生。簡(jiǎn)而言之，損傷心肌細(xì)胞與干細(xì)胞間信息交流是雙向的。那么，干細(xì)胞來源的外泌體是如何促進(jìn)心肌梗死后心臟修復(fù)的呢，可能主要通過以下機(jī)制起作用。

2.1 外泌體促進(jìn)心肌細(xì)胞存活 正常條件下，功能性心肌細(xì)胞中三磷酸腺苷(ATP)的合成主要通過脂肪酸β氧化磷酸化產(chǎn)生，然而在缺血缺氧環(huán)境下，心肌細(xì)胞氧化磷酸化途徑受抑制，ATP生成急劇減少，嚴(yán)重制約了ATP依賴性的離子泵、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成等諸多生物途徑進(jìn)程，最終可導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能異常甚至細(xì)胞凋亡。有學(xué)者在研究糖尿病性心臟病的過程中發(fā)現(xiàn)[7]，無糖預(yù)處理心肌細(xì)胞可促進(jìn)心肌細(xì)胞通過旁分泌途徑分泌外泌體。心肌細(xì)胞來源的外泌體被內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化后，將大量促進(jìn)糖轉(zhuǎn)運(yùn)及糖酵解相關(guān)信息分子傳遞至內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)丙酮酸合成，進(jìn)而提高氧化應(yīng)激狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞的應(yīng)激閾。雖然該研究主要是糖尿病性心臟病個(gè)體的心肌細(xì)胞來源的外泌體作用于內(nèi)皮細(xì)胞，然而我們不難推測(cè)，在缺血性心肌病個(gè)體中損傷心肌細(xì)胞也可能借助外泌體作為載體將促糖轉(zhuǎn)運(yùn)及糖酵解相關(guān)信息分子傳遞至梗死邊緣區(qū)心肌細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)應(yīng)激狀態(tài)下心肌細(xì)胞糖酵解途徑、發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

眾所周知，在缺血缺氧條件下，ATP嚴(yán)重不足，鈣調(diào)節(jié)異常、鈣超載形成，最終可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。miRNA-199a/214家族是缺氧誘導(dǎo)型miRNAs重要組成部分，在心肌缺血及心力衰竭狀態(tài)下呈高表達(dá)水平[8]。研究表明，EPCs所分泌的外泌體中富含miRNA-214[9]，Aurora等[10]也報(bào)道，miRNA-214可通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞鈣平衡相關(guān)基因表達(dá)，如鈉鈣交換蛋白1、細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)子、鈣調(diào)節(jié)蛋白Ⅱdeta、親環(huán)素D等，進(jìn)而抑制鈣超載，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-214還可能通過調(diào)控PTEN/PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)抗氧化應(yīng)激狀態(tài)下心肌細(xì)胞損傷[11]。此外，過表達(dá)GATA4的MSCs來源外泌體通過上調(diào)miRNA-19a激活A(yù)kt及Erk信號(hào)通路起到心肌細(xì)胞保護(hù)作用[12]。

Nakazato等[13]發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激狀態(tài)下心臟組織內(nèi)源性纖維母細(xì)胞來源外泌體可經(jīng)PKC信號(hào)通路調(diào)控心肌細(xì)胞線粒體ATP敏感性鉀離子通道，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，增加心肌細(xì)胞存活率。此外，CPCs來源外泌體通過抑制凋亡執(zhí)行因子Caspase 3/7活化，進(jìn)而抑制心肌細(xì)胞凋亡[14]。

2.2 外泌體促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及血管新生 盡管干細(xì)胞移植治療對(duì)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)下的心肌細(xì)胞保護(hù)作用顯著，然而急性心肌梗死后心肌梗死邊緣區(qū)僅有極少數(shù)細(xì)胞存活。心臟缺血性損傷后，心肌細(xì)胞凋亡/死亡、心臟代償/修復(fù)，終將導(dǎo)致心室重塑、心梗區(qū)瘢痕形成，那么促進(jìn)梗死區(qū)域血管新生的干細(xì)胞效應(yīng)顯得尤為重要。

成年哺乳動(dòng)物心臟中含有固有CPCs/CSCs,具有與心臟細(xì)胞相似的遺傳背景[15]。CPCs源外泌體可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，并且通過上調(diào)miRNA-132及miRNA-146a促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成[14]。miRNA-146與TGF-β協(xié)同作用抑制p120RasGAP表達(dá)，隨后Ras通路活化，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)換[16]；另外miRNA-146a還能通過抑制CARD10進(jìn)而激活NF-κB信號(hào)通路[17]。除了miRNA-132及miRNA-146a參與內(nèi)皮細(xì)胞遷移及血管形成進(jìn)程外，miRNA-320、miRNA-31等亦參與其中，有研究表明，心肌細(xì)胞源性外泌體中miRNA-320與miRNA-216產(chǎn)生拮抗效應(yīng)，被內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)化后通過平衡IGF-1, Hsp20及Ets-2信號(hào)通路，進(jìn)而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖及血管新生等生物學(xué)進(jìn)程；脂肪MSCs來源的外泌體通過miRNA-31上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子-1α平，促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移及管腔形成。此外，外泌體中還攜帶大量效應(yīng)蛋白，如促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子合成、活化NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移及血管形成。

除了CSCs源性外泌體具有促進(jìn)細(xì)胞遷移、血管新生效應(yīng)外，多種干細(xì)胞來源的外泌體亦有相似作用。Bian等通過缺氧預(yù)處理MSCs促進(jìn)外泌體分泌，將外泌體注射進(jìn)急性心肌梗死動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)梗死邊緣區(qū)毛細(xì)血管密度增加，體外研究進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)缺氧預(yù)處理的MSCs源性外泌體可促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管形成，新近亦有報(bào)道稱EPCs源性外泌體也具有EPCs促血管的新生效應(yīng)[9]。

多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞可分泌外泌體，包括干細(xì)胞、體細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等，它存在于多種體液中，細(xì)胞與細(xì)胞間以外泌體為載體進(jìn)行信息交流。越來越多的實(shí)驗(yàn)研究及臨床應(yīng)用已證實(shí)多種干細(xì)胞的外泌體可被靶細(xì)胞內(nèi)化后，改變其生物學(xué)進(jìn)程，進(jìn)而保護(hù)急性缺血缺氧的心臟。近些年，雖然干細(xì)胞移植治療日益成熟，但仍無法避免人倫輿論壓力及致畸致瘤、免疫排斥反應(yīng)、肺栓塞等危害以及移植率、存活率低等難題，并且干細(xì)胞移植后還需進(jìn)行常規(guī)藥物治療，最終無法區(qū)分干細(xì)胞治療與藥物治療為心臟功能改善貢獻(xiàn)孰重孰輕。

近些年，在心肌梗死后心臟再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中干細(xì)胞源性外泌體研究熱度持續(xù)升溫。大量研究表明，不同種類來源的外泌體具有干細(xì)胞相似效應(yīng)，可通過促進(jìn)促進(jìn)細(xì)胞遷移、促進(jìn)血管新生、抗細(xì)胞凋亡、抗炎癥等效應(yīng)。在心肌細(xì)胞間、心肌層間以及心肌組織與其他組織間，外泌體作為重要的細(xì)胞間信息交流媒介參與細(xì)胞的各種生物學(xué)進(jìn)程。外泌體根據(jù)其不同細(xì)胞來源可攜帶細(xì)胞特異性信息分子(包括蛋白因子、miRNAs、lncRNAs、脂質(zhì)體以及基因片段)以及特異性膜受體，并且對(duì)低滲微環(huán)境耐受，可在細(xì)胞間高效傳遞信息，其作為心肌梗死后干細(xì)胞非細(xì)胞治療新策略無可厚非。

臨床推廣前需解決的問題可能為：①干細(xì)胞來源是否符合倫理及其獲取的難易程度；②如何從干細(xì)胞中獲取大量外泌體，如缺氧誘導(dǎo)、基因修飾及表觀遺傳修飾等；③目前外泌體提取技術(shù)多為超速離心法或試劑盒法，需挖掘高效且快速提取的新方法；④外泌體內(nèi)成分復(fù)雜，需進(jìn)一步了解各種效應(yīng)成分之間的作用及其機(jī)制；⑤即便大量臨床前實(shí)驗(yàn)已證明外泌體治療缺血性心肌病的安全性，但仍需進(jìn)一步考察，如外泌體干預(yù)后畸胎瘤的發(fā)生等?？傊m然外泌體在動(dòng)物研究中取得了巨大成果，但若將其向臨床推廣還需要大量基礎(chǔ)及臨床研究進(jìn)一步探索。

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