冠心病患者9p21染色體位點CDKN2A、CDKN2B、MTAP及ANRIL的表達變化

王文杰，申社林

(邢臺醫(yī)學高等?？茖W校，河北邢臺054000)

據(jù)我國流行病學資料顯示，我國冠心病患病人數(shù)已達2.3億，且年新發(fā)病人數(shù)高達60萬，每天死亡9 590人，是我國首要死亡原因[2]。當前冠心病病因研究雖然并未完全明確，但遺傳因素和環(huán)境因素是公認的主要病機。環(huán)境因素包括性別、年齡、肥胖、高血脂、高血壓、不良生活習慣等[3～5]，但僅可解釋50%～60%冠心病的發(fā)病原因，而其余40%～50%的冠心病的發(fā)病原因則歸因于遺傳因素[6]，因此，遺傳因素方面的病因也是冠心病發(fā)病機制研究熱點。Shea 等[7]首次報道了白種人冠心病的易感位點基因，如CDKN2A、CDKN2B、MTAP、ANRIL等，而這些基因均為9p21染色體區(qū)域相關(guān)基因。由于易感位點基因存在人種差異，且國內(nèi)尚無9p21染色體區(qū)域冠心病易感位點基因的相關(guān)報道。因此，本研究擬探討冠心病患者9p21染色體位點CDKN2A、CDKN2B、MTAP及ANRIL的表達變化。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2017年1～8月邢臺市人民醫(yī)院住院治療的冠心病患者30例為病例組，以同期健康體檢人群30例為對照組。病例組入選標準：①臨床癥狀及心電圖顯像符合中華醫(yī)學會心血管病學分會《中國心血管病預防指南》[8]冠心病診斷標準；②冠狀動脈造影顯示，至少有1支冠狀動脈管腔狹窄至少50%；③所有入選冠心病患者無血緣關(guān)系；④所有入選冠心病患者民族均為漢族。病例組排除標準：①合并擴展型心臟病、風濕性心臟病等其它心血管疾病患者；②具有嚴重肝、腎疾病及全身性免疫系統(tǒng)疾病患者；③曾接受靜脈溶栓術(shù)、心臟大型手術(shù)患者。對照組納入排除標準：均為漢族，病史詢問、體檢確診為非冠心病，且本人、家族直系三代無冠心病史。所有研究對象經(jīng)知情同意后，采集空腹抗凝靜脈血2 mL，本研究樣本選取及實驗檢測均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準同意。

1.2 外周血總RNA提取 采用TRIzol法，主要提取步驟為：①新鮮血液2 mL置于離心管內(nèi)，加入6 mL紅細胞裂解液混勻后，4 ℃ 12 000 r/min離心處理2 min，棄上清紅色液體；②沉淀部分加入4 mL紅細胞裂解液混勻后，4 ℃ 12 000 r/min離心處理2 min，棄上清紅色液體；③沉淀部分加入4 mL PBS溶液混勻后，4 ℃ 12 000 r/min離心處理2 min，棄上清液體；④沉淀部分加入1 mL TRIzol溶液混勻，室溫下靜置10 min；⑤再加入0.2 mL氯仿混勻后，4 ℃下以12 000 r/min離心處理15 min，棄上清液體，保留底部針尖大小白色物質(zhì)；⑥再加入1 mL的70%乙醇旋轉(zhuǎn)洗滌，4 ℃ 12 000 r/min離心處理5 min，去除乙醇加入30 μL DEPC水融解沉淀，得到外周血總RNA樣品液。

1.3 外周血cRNA合成 反轉(zhuǎn)錄體系配置：①RNase Free DH2O(20 μL)；②Prime Script TM Buffer×5(1 μL)；③Prime Script TM RT Enzyme Mix I(1 μL)；④Oligo d T Primer(1μL)；⑤Random 6 mer(1 μL)；⑥Total RNA(500 ng)。將上述反轉(zhuǎn)錄體系溶液混勻后，在反應(yīng)條件(37 ℃ 10 min，85 ℃ 10 s，4 ℃ 1 h)中可合成外周血cRNA。

1.4 引物設(shè)計與合成 以9p21染色體區(qū)域的CDKN2A基因、CDKN2B基因、MTAP基因和ANRIL基因作為候選基因，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用primer 5.0進行引物設(shè)計。其中候選基因β-actin正向引物：5’-ACAGTGGAAGTGGCAAGGTC-3’，反向引物：5’-GTTTCAAGTATTACACCGGC-3’，CDKN2B正向引物：5’-TCAGTCGGCTTCCGAGGTA-3’，反向引物：5’-GTTGCGTGGTTCAATGCC-3’； ANRIL正向引物：5’-GAGAGAACCTTAGGAAACTTTACAG-3’， 反向引物：5’-ACACCATCAATCCCACACCATACAC-3’； MTAP正向引物：5’-ACGAAGGAGCACGAGGAAG-3’， 反向引物：5’-CTATCCCAGGTCTCTTACCAGTC-3’； CDKN2A正向引物：5’-TCAGTCGGCTTCCGAGGTA-3’，反向引物：5’-GTTCCGTGGAGCGCGTA-3’。引物合成送寶生物公司合成。

1.5 各組mRNA表達量測定 PCR擴增體系：①PCR Reverse Primer(0.5 μL)；②SYBR Premix Ex Taq TM(12.5 μL)；③ROX Reference Dye Ⅱ(0.5 μL)；④PCR Forward Primer(0.5 μL)；⑤cRNA樣品液(2 μL)；⑥dH2O(9 μL)。將上述PCR擴增體系溶液混勻后，在實時熒光 PCR擴增儀中以反應(yīng)條件(95 ℃ 30 s，95℃ 5 s，60 ℃ 20 s)進行反應(yīng)，共循環(huán)40次后，測定兩組CDKN2A、CDKN2B、MTAP和ANRIL的mRNA表達水平。

2 結(jié)果

與對照組相比，病例組的外周血9p21染色體區(qū)域的CDKN2A、CDKN2B mRNA表達水平降低(P均<0.05)，MTAP mRNA表達水平升高(P<0.05)，ANRIL mRNA表達水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 兩組CDKN2A、CDKN2B、MTAP和ANRIL的mRNA表達比較

3 討論

遺傳因素是當前冠心病的病因及發(fā)病機制研究中的熱點方向。家族聚集性是冠心病明顯的遺傳病特征，即具有冠心病家族史人群的冠心病患病風險是無冠心病家族史人群的12倍，且這種高患病風險存在種族差異[9]。但是冠心病作為一種復雜的多基因遺傳病，其顯著特點是不符合孟德爾遺傳的質(zhì)量性狀變異，存在著數(shù)量級差改變，即冠心病病因和發(fā)病機制可能存在多種易感基因或易感區(qū)域[10]，因此冠心病遺傳基因研究頗為復雜。但隨著人類基因組計劃的進展和單核苷酸多態(tài)性研究的不斷進步，使基于候選基因策略的全基因組關(guān)聯(lián)研究法成為冠心病遺傳基因研究的主要方法。全基因組關(guān)聯(lián)研究法又稱為連鎖不平衡研究法，是一種通過疾病人群和健康對照人群間遺傳標記基因表達差異，來分析疾病相關(guān)致病基因的有效方法。由于全基因組關(guān)聯(lián)研究法，既不需要了解致病基因在全基因組中的位置，也不需要假定疾病的相關(guān)基因，因此在冠心病遺傳基因研究中的應(yīng)用越來越廣泛[11]。

當前，國內(nèi)外學者采用候選基因策略的全基因組關(guān)聯(lián)研究法，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)較多與冠心病病情發(fā)展相關(guān)的基因易感位點和基因易感區(qū)域，這無疑是冠心病基因研究的一個進步。而這些基因易感位點和基因易感區(qū)域主要集中在9p21染色體區(qū)域，使9p21染色體位點成為被廣泛關(guān)注的熱點。本世紀初，《Science》報道了美國、加拿大、英國等學者的相關(guān)報道，其研究顯示9p21染色體位點是白種人群的冠心病易感位點[12,13]。之后芬蘭、瑞典、法國、愛爾蘭、日本等國為主的一個國際合作研究小組，分別對自己所在國冠心病人群的9p21染色體區(qū)域基因進行了研究，印證了9p21染色體區(qū)域基因與冠心病發(fā)病的關(guān)系[14]。9p21染色體位點具有高度的不平衡特性，目前研究顯示，與9p21染色體位點相關(guān)聯(lián)的基因主要包括CDKN2A、CDKN2B、ANRIL 和MTAP[15]。

CDKN2A和CDKN2B基因均屬于9p21染色體區(qū)域基因編碼周期，均屬于依賴性蛋白激酶家族成員，主要在細胞周期調(diào)節(jié)中產(chǎn)生抑制細胞增殖作用，且與冠心病的動脈粥樣硬化發(fā)病機制密切相關(guān)[16]。已經(jīng)有研究顯示CDKN2A和CDKN2B基因位于9p21染色體位點上游，與白種人冠心病發(fā)病密切相關(guān)[17]。ANRIL基因為9p21染色體位點的一種反義非編碼RNA基因，主要表達于血管巨噬細胞、血管上皮組織細胞及動脈粥樣硬化板塊細胞之中，其通過轉(zhuǎn)錄來控制該病細胞增殖通路相關(guān)基因的表達[18]。近年研究顯示，冠心病患者的單核細胞和動脈粥樣硬化斑塊組織中，9p21染色體位點的ANRIL 基因呈高表達，提示ANRIL 與冠心病患者動脈粥樣硬化有關(guān)，推測ANRIL基因可促進9p21染色體變異，從而促進動脈粥樣硬的發(fā)生[19]。MTAP 基因在甲硫腺苷磷酸化酶的代謝中起重要作用，有文獻研究顯示MTAP 基因多態(tài)性與缺血性腦卒中、心肌梗死的發(fā)生具有相關(guān)性[20]。因此將9p21染色體位點相關(guān)聯(lián)的CDKN2A、CDKN2B、ANRIL和MTAP基因作為候選基因，探討其與冠心病的冠心，可以為冠心病臨床診治提供新的靶向基因。本研究結(jié)果顯示,與對照組相比，冠心病病例組的外周血9p21染色體區(qū)域的CDKN2A、CDKN2B mRNA表達水平明顯降低，這可能是由于CDKN2A基因和CDKN2B基因作為一種具有抑制細胞增殖作用的基因，其在細胞周期調(diào)節(jié)中的抑制作用受到限制，因此導致患者冠心病發(fā)病風險的增大。MTAP mRNA表達水平明顯升高，這可能是因為MTAP 基因作為一種具有促進細胞代謝功能的基因[21]，作用于慢性進展性的冠心病，其表達上調(diào)加速了冠心病的進展。ANRIL mRNA表達水平無明顯差異，提示ANRIL基因可能與冠心病發(fā)生發(fā)展無關(guān)，與國外研究存在差異，原因可能在于人種差異和病例樣本較小。

綜上所述,冠心病的發(fā)生可能與9p21染色體位點CDKN2A、CDKN2B表達下降和MTAP 表達升高有關(guān)，9p21染色體位點CDKN2A、CDKN2B和MTAP 有希望成為冠心病臨床診治的潛在靶基因。

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