生長調(diào)節(jié)劑對紅豆杉內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇的影響

趙赟鑫 張歡 張顏青

摘要：根據(jù)紫杉醇的結(jié)構(gòu)特點和紅豆杉中紫杉醇的合成機制，選取4種生長調(diào)節(jié)劑，研究其對紅豆杉內(nèi)生真菌合成紫杉醇的影響。結(jié)果表明，在發(fā)酵過程的第10天，補加下列任一生長調(diào)節(jié)劑，使發(fā)酵液中初始濃度分別達到水楊酸20.0 mg/L，茉莉酸甲酯100.0 μmol/L，赤霉素2.0 mg/L，矮壯素2.0 mg/L，均能提高紫杉醇產(chǎn)量。同時，在發(fā)酵過程的第10天補加蔗糖，在含量不高于15 g/L時，對紫杉醇的積累和菌絲體生長具有促進作用，但是高于此濃度時，菌絲體生長受抑制，紫杉醇含量降低。

關(guān)鍵詞：紅豆杉;紫杉醇;內(nèi)生真菌;生長調(diào)節(jié)劑

中圖分類號： Q939.9 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0120-04

近年來，紅豆杉產(chǎn)紫杉醇的研究進展很快，國內(nèi)外利用內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇的研究報道逐漸增多，目前內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇的含量普遍偏低，國內(nèi)外學(xué)者也正在不斷探索能夠提高內(nèi)生真菌產(chǎn)紫杉醇產(chǎn)量的途徑[1-2]。

誘導(dǎo)子是一種能誘導(dǎo)植物細胞中一種或多種反應(yīng)并形成特征性自身防御反應(yīng)的分子，是能夠引起植物過敏反應(yīng)的物質(zhì)，其在與植物的相互作用中，能夠快速、高度專一和選擇性地活化植物次級代謝途徑中特定酶的基因或改變次級代謝途徑中催化酶的酶活力，誘導(dǎo)植物形成新酶，進而活化特定次生代謝途徑，引起反應(yīng)速率和次級代謝途徑通量的改變，從而積累特定目的次級的代謝物，因此可以利用誘導(dǎo)子來提高植物次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[3]。

紫杉醇是紅豆杉屬植物及其內(nèi)生真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，非生物或生物誘導(dǎo)子可誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生抗逆反應(yīng)，啟動次級代謝途徑，進而合成大量的紫杉醇。通常，誘導(dǎo)子對紅豆杉細胞的生長均有抑制作用，因而添加時間、添加濃度對誘導(dǎo)子作用的最終效果非常關(guān)鍵[4]。添加代謝抑制劑，以抑制一些與紫杉醇生物合成無關(guān)的次級代謝途徑為目的，通過添加某些代謝旁路抑制劑，將細胞的物質(zhì)和能量導(dǎo)向紫杉醇生物合成途徑，從而提高紫杉醇的產(chǎn)量。當然，代謝抑制劑也存在一個最佳添加濃度和最佳添加時間[5]。

大量研究表明，在對數(shù)生長末期添加前體物質(zhì)、誘導(dǎo)子及代謝抑制劑的效果最好，因為此時細胞已得到較好的增殖，而且在此階段，植物細胞接受生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的信號能力最強[6]。

作者采用課題組自行分離的紫杉醇高產(chǎn)菌株綠僵菌（Metarhizium anisopliae） LB-10[7]，在對其培養(yǎng)基組成和配比[8]、發(fā)酵條件研究[9]的基礎(chǔ)上，根據(jù)紫杉醇的結(jié)構(gòu)特點和紅豆杉中紫杉醇的合成機制，選取4種生長調(diào)節(jié)劑，研究其對紅豆杉內(nèi)生真菌合成紫杉醇的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 紅豆杉內(nèi)生真菌Metarhizium anisopliae LB-10是分離自陜西省漢中市留壩縣野生紅豆杉的高產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，水1 L，pH值自然;種子培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20.0 g，水1.0 L，pH值6.0～8.0;發(fā)酵液：葡萄糖50.0 g/L，NH4NO3 6.0 g/L，無水MgSO4 0.3 g/L，KH2PO4 0.5 g/L，維生素B1 5.0×10-2 g/L。

1.1.3 藥品與試劑 紫杉醇標準品（≥98%）、乙酸乙酯、甲醇、葡萄糖、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、苯甲酸鈉、苯丙氨酸、乙酸鈉、酪氨酸。

1.1.4 主要儀器 高效液相色譜儀（LC 2000），旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RV-10，IKA），電子天平（TB-214），雙層恒溫干燥培養(yǎng)振蕩器（ZHWY-2102C），人工氣候箱（LRH-250-G-S），數(shù)控超聲波清洗儀（KQ-5200-DE）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法 種子液培養(yǎng)方法：在新鮮斜面上取 5 mm×5 mm大小的已純化的菌塊，接種到裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于25 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng) 3 d。

發(fā)酵培養(yǎng)：將培養(yǎng)好的種子液混勻，按3%接種量接種到裝有330 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，每次提取所用發(fā)酵液的量為1 000 mL，于28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)10 d。

1.2.2 紫杉醇樣品的提取 通過對培養(yǎng)10 d的發(fā)酵液進行抽濾，使其分離為菌液和菌絲體2個部分，菌絲用乙酸乙酯在超聲條件下萃取，菌液用乙酸乙酯通過分液漏斗萃取，分別重復(fù)3次，合并收集到的乙酸乙酯相，并用雙層濾紙過濾，濾液在40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，樣品用甲醇溶解并且定容至 10.0 mL，檢測。

1.2.3 紫杉醇的HPLC檢測 紫杉醇標準品用甲醇定容至10.0 mL，配制成0.01～0.16 mg/mL的濃度梯度，繪制標準曲線。精確稱取紫杉醇標準品4.0 mg，甲醇定容至10.0 mL，從而得到母液濃度為0.4 mg/mL，將母液依次稀釋成濃度梯度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/mL，取20.0 μL進樣（N=5），得到回歸方程為y=6.087 8+3 589.391 3x，r=0.999 222。建立標準曲線，如圖1所示，采用外標法測定內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物的乙酸乙酯抽提物中紫杉醇的含量。

色譜條件：水-甲醇-乙腈（體積比33 ∶ 35 ∶ 32）為流動相，檢測波長為228 nm，流速為1.0 mL/min，進樣量為 20.0 μL，柱溫為室溫，色譜柱：C18（4.6 mm×150 mm）。

紫杉醇含量的計算公式：發(fā)酵液中紫杉醇含量（μg/L）=[甲醇中紫杉醇含量（mg/mL）×溶解提取物所用甲醇體積（mL）×106]/提取時所取發(fā)酵液體積（mL）。

每次提取的紫杉醇均做3個平行樣，分別經(jīng)HPLC測定并通過公式計算發(fā)酵液中紫杉醇的含量，求其平均值。

1.2.4 生物量的測定 取一定體積的發(fā)酵液4 800 r/min離心20 min，菌絲體用蒸餾水洗滌2次，收集菌絲體，置于80 ℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，稱量，計算菌絲體生物量。

1.2.5 添加誘導(dǎo)子的研究方法 以水楊酸為誘導(dǎo)子，采用蒸餾水作為助溶劑，在菌株LB-10對數(shù)生長末期即第10天，添加水楊酸水溶液，使發(fā)酵液中其初始濃度分別達到5.0、10.0、20.0、40.0、80.0 mg/L，并作空白對照，研究水楊酸對菌株LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成的影響。

以茉莉酸甲酯為誘導(dǎo)子，采用乙醇作為助溶劑，在菌株LB-10對數(shù)生長末期即第10天，添加茉莉酸甲酯醇溶液，使發(fā)酵液中其初始濃度分別達到50.0、75.0、100.0、125.0、150.0 μmol/L，并作空白對照，研究茉莉酸甲酯對菌株LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成的影響。

1.2.6 添加抑制劑的研究方法 以赤霉素為抑制劑，采用蒸餾水為助溶劑，在菌株LB-10對數(shù)生長末期即第10天，添加赤霉素水溶液，使發(fā)酵液中其初始濃度分別達到0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L，并作空白對照，研究赤霉素對菌株LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成的影響。

以矮壯素為抑制劑，采用蒸餾水為助溶劑，在菌株LB-10對數(shù)生長末期即第10天，添加矮壯素水溶液，使發(fā)酵液中其初始濃度分別達到0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/L，并作空白對照，研究矮壯素對菌株LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成的影響。

1.2.7 培養(yǎng)基中補加蔗糖的研究方法 在菌株LB-10對數(shù)生長末期即第10天，添加蔗糖水溶液，使發(fā)酵液中其初始濃度分別達到5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 g/L，并作空白對照，研究補加蔗糖對菌株LB-10菌絲體生物量和紫杉醇生物合成的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)子的影響

2.1.1 水楊酸的影響 水楊酸是酚類化合物，為白色結(jié)晶性粉末，易溶于水，微溶于乙醇和乙醚。主要作為植物抗病反應(yīng)的重要信號分子，能夠激活多種與抗病相關(guān)的植物防御機制。涉及并參與系統(tǒng)獲得抗性反應(yīng)和植物過敏反應(yīng)，在植物抗病反應(yīng)中起重要的作用。水楊酸可分為內(nèi)源水楊酸和外源水楊酸，前者能夠誘導(dǎo)與抗病蛋白有關(guān)基因的表達，而后者則主要誘導(dǎo)防御反應(yīng)的產(chǎn)生[10]。試驗結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，在0～20 mg/L濃度范圍，水楊酸對紫杉醇合成有明顯的促進作用，在20 mg/L時紫杉醇含量達到 986.1 μg/L，繼續(xù)增加濃度后紫杉醇含量開始下降。而且水楊酸含量在高于5.0 mg/L后，對菌絲體生長具有明顯的抑制作用。由于水楊酸誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生過敏反應(yīng)，能夠提高與次生代謝物合成相關(guān)酶的活性[11]，從而促進細胞積累紫杉醇，所以水楊酸對紫杉醇合成具有顯著性影響，但過高濃度的水楊酸會嚴重影響細胞的生長，反而使紫杉醇含量下降，因而須選擇合適的水楊酸添加劑量。

2.1.2 茉莉酸甲酯的影響 茉莉酸類作為與損傷相關(guān)的植物激素和信號分子，在自然界廣泛存在，其主要代表物為茉莉酸和茉莉酸甲酯，茉莉酸甲酯的外源應(yīng)用能夠激發(fā)防御植物基因的表達，誘導(dǎo)植物的化學(xué)防御，產(chǎn)生與機械損傷和昆蟲取食相似的效果[12]。由圖3可知，茉莉酸甲酯濃度在0～100 μmol/L 范圍內(nèi)時，隨著濃度的升高，紫杉醇含量也逐漸增高，在添加 100 μmol/L 時，紫杉醇含量達到996.2 μg/L，但繼續(xù)提高濃度，生物合成紫杉醇含量下降，而且在試驗范圍內(nèi)，茉莉酸甲酯對菌絲體生長有明顯的抑制作用。在茉莉酸甲酯的誘導(dǎo)作用下，菌絲體生長和紫杉醇的合成呈負相關(guān)關(guān)系。由于茉莉酸甲酯可激活特定防御基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯[13]，最終促進次級代謝產(chǎn)物的合成，所以茉莉酸甲酯對紫杉醇合成是一種非常有效的誘導(dǎo)子。但由于茉莉酸甲酯會影響菌絲體的生長，反而使紫杉醇含量下降，因而須選擇合適的茉莉酸甲酯添加劑量。

2.2 抑制劑的影響

2.2.1 赤霉素的影響 赤霉素是雙萜類化合物，化學(xué)結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，易溶于水，其最突出的生理效應(yīng)是能顯著地促進莖的伸長、能夠引起某些植物形成單性果實和誘導(dǎo)長日植物在短日條件下開花，對某些生理現(xiàn)象有時有抑制作用[14]。由圖4可知，在0～2.0 mg/L濃度范圍內(nèi)，赤霉素對紫杉醇合成有一定的促進作用，在2.0 mg/L時紫杉醇含量達到 1 015.2 μg/L，繼續(xù)增加濃度后紫杉醇含量逐漸下降，而且赤霉素在低濃度下對菌絲體生長具有一定的促進作用，但當濃度高于0.5 mg/L時，對生物量的積累具有明顯的抑制作用。由于赤霉素類化合物與紫杉醇具有一個同樣的赤霉烷二萜母核，所以甲羥戊酸途徑是其合成途徑，并且也是由牻牛兒基焦磷酸（GGPP）環(huán)合而成[15]。在甲羥戊酸途徑中的許多酶活性是受其代謝產(chǎn)物的反饋抑制，而赤霉素也有相似的作用，那么添加的赤霉素可能會抑制由GGPP合成赤霉素類化合物，為紫杉醇的合成提供更多的基礎(chǔ)物質(zhì)，從而提高紫杉醇的生物合成量;由于赤霉素濃度的提高，對菌絲體生長具有明顯的抑制作用，導(dǎo)致紫杉醇含量下降。

2.2.2 矮壯素的影響 矮壯素即氯化氯膽堿，是一種能夠與赤霉素發(fā)生拮抗作用的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，屬于甾體合成代謝抑制劑[16]，其生理作用是控制植株的營養(yǎng)生長和生殖生長，使植株的間節(jié)縮短、矮壯并抗倒伏。由圖5可知，在0～2.0 mg/L 濃度范圍內(nèi)，矮壯素對紫杉醇合成有一定的促進作用，在2.0 mg/L時紫杉醇含量最高，達到1 032.5 μg/L，繼續(xù)增加濃度后紫杉醇含量逐漸下降。而且還發(fā)現(xiàn)矮壯素對菌株LB-10的菌絲體生長有明顯的抑制作用。由于矮壯素可以抑制赤霉素合成途徑中的環(huán)化步驟，此作用與上述假設(shè)的赤霉素反饋抑制作用基本相同。同時，矮壯素能抑制固醇的合成，而固醇抑制甲羥戊酸途徑中限速酶3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMG-CoA）的活性[17]，所以添加矮壯素能夠間接地提高HMG-CoA的活性，從而促進甲羥戊酸途徑的代謝，間接地促進紫杉烷類化合物和紫杉醇的合成。隨著矮壯素濃度的增加，會對菌絲體生長產(chǎn)生明顯地抑制，從而限制了紫杉醇含量的增加。

2.3 培養(yǎng)基補加蔗糖的研究

微生物培養(yǎng)基中經(jīng)常使用蔗糖作為碳源，它的主要作用就是用于合成微生物細胞物質(zhì)以及提供能量，蔗糖在微生物體內(nèi)經(jīng)常被降解成果糖和葡萄糖，其中果糖對細胞培養(yǎng)后期合成紫杉醇有促進作用，而葡萄糖主要是在細胞的前期生長中利于獲得大量的細胞。在培養(yǎng)到第10天時，營養(yǎng)物質(zhì)基本已消耗殆盡，考慮在此時添加不同濃度的蔗糖，使其發(fā)酵液中的蔗糖濃度范圍在0～25 g/L之間。由表2、圖6可知，在發(fā)酵液中蔗糖濃度為15 g/L時，菌體能快速生長和繁殖，紫杉醇產(chǎn)量和生物量最高，其中紫杉醇含量達到984.2 μg/L，而第5試驗組的發(fā)酵液與對照組相比，其發(fā)酵液的黏度較大，呈糊狀，紫杉醇含量也比較低。間隔補加蔗糖，隨著蔗糖濃度的提高，其滲透壓相應(yīng)地提高，導(dǎo)致膜蛋白降解，從而增加了菌體的通透性，使得代謝產(chǎn)物更多地向胞外釋放，促進代謝產(chǎn)物的生物合成速率，進而提高其產(chǎn)量，但在后期，由于過高的蔗糖濃度和大量的菌絲體量導(dǎo)致發(fā)酵液黏度明顯增加，使菌絲體呼吸困難，從而抑制了紫杉醇的生物合成量。因此補加的蔗糖量一定要根據(jù)菌株的特性和發(fā)酵條件適量添加。

3 結(jié)論與討論

代謝調(diào)控是通過定向改良細胞的代謝特性，對特定的生化反應(yīng)進行修飾，從而實現(xiàn)合成新產(chǎn)物或提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)率以及減少副產(chǎn)物的產(chǎn)率。在正常的生理條件下，微生物總是通過協(xié)調(diào)系統(tǒng)最經(jīng)濟地吸收和利用營養(yǎng)物質(zhì)，用于合成細胞結(jié)構(gòu)，進行生長和繁殖，一般不積累中間代謝產(chǎn)物。代謝人工調(diào)控就是打破微生物的代謝控制體系，使代謝朝著人們希望的方向進行。因此，在了解紫杉醇生物合成途徑和催化各步反應(yīng)酶的特性后，有目的地控制培養(yǎng)條件，通過添加重要的前體物質(zhì)、誘導(dǎo)子及抑制劑，對關(guān)鍵酶的活性進行調(diào)節(jié)，抑制其他無用的旁路途徑，是完全可以提高紫杉醇產(chǎn)量的。

本研究根據(jù)紅豆杉紫杉醇的合成機制和紫杉醇的結(jié)構(gòu)特點，選取水楊酸、茉莉酸甲酯、赤霉素和矮壯素分別作為生長調(diào)節(jié)劑，研究其對Metarhizium anisopliae LB-10合成紫杉醇的影響。結(jié)果表明，在發(fā)酵過程中第10天補加下列任一生長調(diào)節(jié)劑，使發(fā)酵液中初始濃度分別達到水楊酸20.0 mg/L、茉莉酸甲酯100.0 μmol/L、赤霉素2.0 mg/L、矮壯素2.0 mg/L，均能提高紫杉醇產(chǎn)量。

通過研究在液體發(fā)酵過程中補加蔗糖對菌株LB-10的紫杉醇含量和菌絲體生物量的影響。結(jié)果顯示，蔗糖含量在不高于15 g/L時，對紫杉醇積累和菌絲體生長具有促進作用，但是高于此濃度時，菌絲體生長受抑制，進而降低了紫杉醇含量。

紫杉醇具有細胞毒害作用[18]，通常不會大量地合成，只有在特殊環(huán)境脅迫條件下，初生代謝受到抑制，次生代謝產(chǎn)物才會大量合成。在試驗過程中，筆者所在課題組發(fā)現(xiàn)添加某些生長調(diào)節(jié)劑，在紫杉醇產(chǎn)量較高時，生物量卻較低。這就造成紫杉醇生物合成和菌絲體生長之間的矛盾，所以找到二者最佳平衡點是接下來須要解決的問題，也是實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的必要條件。

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