牛及其他各物種SLC11A1基因的結構多態(tài)與疾病相關性的研究進展

王利平 苑夢雅 劉相瑩

摘要：SLC11A1基因與許多種胞內病原菌如沙門氏桿菌、結核分枝桿菌和利什曼原蟲等病原菌的抗性和易感性有關，作為牛綜合抗病的優(yōu)良候選基因之一，它對于疾病的抵抗性是屬于非病原特異性的。綜述SLC11A1基因的結構特點、作用機制、表達調控，重點綜述牛和其他不同物種SLC11A1基因結構多態(tài)與疾病的相關性，有望對牛的抗病育種提出理論依據(jù)。

關鍵詞：SLC11A1基因;結構特征;作用機制;疾病抗性;易感性

中圖分類號： S858.23 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0001-04

抗病或感病是指動物在生長發(fā)育過程中受到各種病原物侵襲時的表現(xiàn)。隨著分子生物學技術的發(fā)展，通過篩選鑒定抗病相關基因及其分子標記的方式，培育出抗病力較強的畜禽品種，從而達到提高當下畜牧生產水平的目的。溶質轉運蛋白家族是一類膜轉運蛋白，也是一類pH值依賴性二價陽離子反向轉運蛋白，鑒于其亞細胞位于巨噬細胞靜止晚期細胞內腔，因此會伴隨著巨噬細胞吞噬病原體之后轉移到吞噬體膜[1-3]。該家族包括SLC11A1和SLC11A2共2類[4]。SLC11A1基因比較保守，主要在免疫系統(tǒng)組織器的巨噬細胞、血液外周白細胞、嗜中性粒細胞以及脾臟、肺臟中表達，影響動物的天然免疫。最近，西北農林科技大學的張涌教授團隊應用基因打靶編輯技術把SLC11A1基因插入牛的胎兒成纖維細胞，通過體細胞轉移，最終得到對結核桿菌病具有較強抵抗力的轉基因牛，又一次證明了SLC11A1基因在抗病育種中是一個良好的候選基因[5-6]。

1 溶質載體轉運蛋白家族基因SLC11A1的發(fā)現(xiàn)

溶質載體轉運蛋白家族11成員1（Solute carrier family 11 member 1：SLC11A1），又名天然抗性相關巨噬細胞蛋白1基因（natural resistance associated macrophage protein 1，NRAMP1），最初在小鼠中發(fā)現(xiàn)并被克隆。Ity、Lsh和Bcg[7]也是該基因的名稱，來源于該基因能夠控制早期感染的鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）、杜氏利氏曼菌（Leishmaniadonovani）以及與之相關的各種分枝桿菌包括牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis）、麻風分枝桿菌（Mycobacterium lepraemurium）。

2 溶質載體轉運蛋白家族基因SLC11A1的功能

盡管關于SLC11A1基因作用機制的研究尚未有一致結論，但以下5個方面已經基本達成共識（圖1）：（1）SLC11A1基因把溶酶體的金屬離子耗盡之后發(fā)揮作用，導致被吞噬的胞內病原體缺乏繁殖所必需的鎂、鐵和其他金屬離子[8];（2）巨噬細胞中的“多向性效應”可在吞噬體單向轉運二價金屬離子時被激活，包括抗原遞呈、蛋白激酶C產生、NO產生等功能的上調，其中脂多糖增多、IFN-γ（γ-干擾素）、TNF-α（腫瘤壞死因子-α）、IL-1β（白細胞介素1β）表達增強，皆是引起上調作用的刺激因子[9-10]。（3）細菌被吞噬細胞內吞后，F(xiàn)e2+等金屬離子作為輔助因子能夠合成自身的防御酶系來抗衡內吞小體產生的活性氧或氮的中間產物NO和NO2等，這些金屬離子可以被SLC11A1基因運出內吞小體造成細菌無法合成防御酶系，因此活性氧可以殺死細菌[11];（4）鐵離子能通過SLC11A1基因轉運到吞噬體，參與Fenton（芬頓）和Haber-Weiss（哈伯·韋斯）反應，產出大量活性離子殺滅微生物[12];（5）SLC11A1基因受到金屬轉運蛋白基因Fpn1、Dmt1和TfR的表達調控的影響，胞內金屬離子的濃度降低，病原微生物的生長受到限制，有利于誘生型一氧化氮合酶（iNOS）的轉錄，產生更多的活性氧來發(fā)揮抗病作用[13-14]。

3 多物種SLC11A1基因多態(tài)對疾病易感性和抗性的關聯(lián)

早期研究表明，SLC11A1基因具有控制鼠傷寒沙門氏菌[15]、杜氏利氏曼菌[16]以及各種分支桿菌包括麻風分支桿菌、牛分支桿菌早期感染的功能[17-18]。SLC11A1基因多態(tài)與抗病性在人及多種動物（豬、家禽等）上有大量報道，相對應的疾病有傷寒病、結核病、乳腺炎、布氏桿菌病、大腸桿菌病等[19-22]。

3.1 小鼠SLC11A1基因蛋白產物與抗病性的關聯(lián)

在小鼠巨噬細胞中，SLC11A1基因表達通過含有LAMP1蛋白的溶酶體可被快迅速轉移到含有活體細菌（如沙門氏菌等胞內病原微生物）的吞噬小體中發(fā)揮作用[23-24]。通過基因缺失、體外及轉基因鼠體內等不同試驗表明，SLC11A1基因與

小鼠對沙門氏傷寒菌、結核桿菌、利什曼菌、大腸桿菌等胞內病原微生物的抗性和易感性相關[8，24-25]。Vidal等在小鼠對病原微生物的抗性和易感性研究中發(fā)現(xiàn)，因為基因突變導致SLC11A1基因功能喪失的小鼠早期感染時表現(xiàn)為免疫力降低，在感染后期免疫功能得到恢復，這一現(xiàn)象證明了SLC11A1基因在巨噬細胞與病原微生物相互作用的早期免疫階段發(fā)揮著重要作用[8]。

3.2 人SLC11A1基因變異與疾病的關聯(lián)

與人結核病相關的SLC11A1基因的3個多態(tài)位點已被發(fā)現(xiàn)，分別為3′非編碼區(qū)（3′UTR）的TGTG缺失、第543密碼子位點的單堿基轉換（D543N）、內含子4的G→C點突變。韓國肺結核患者與SLC11A1的3′UTR多態(tài)性顯著相關[26]。SLC11A1內含子4的點突變和3′UTR區(qū)域多態(tài)性與人結核性胸膜炎緊密相關[27]。對我國漢族結核病人群的研究發(fā)現(xiàn)，痰涂片檢測陽性的結核均與SLC11A1基因INT4和D543N位點多態(tài)性顯著相關，雜合子個體較純合子個體感染結核病的概率更高。由于漢族人3′UTR區(qū)域的TGTG缺失基因頻率明顯高于白種人，因此部分漢族人相比白種人更容易患結核病[28]。另有報道SLC11A1基因多態(tài)性與非結核性分枝桿菌肺病易感性存在相關性[29]。在我國北方漢族人肺結核成人患者的研究中也表明，D543N與3′UTR位點多態(tài)性可能是肺結核易感的原因[30-31]。人SLC11A1基因可能與鳥型分枝桿菌復合感染易感性有關，通過基因分型發(fā)現(xiàn)患者中D543N和3′UTR區(qū)域2個位點雜合子相對較多[32]。研究人的SLC11A1基因啟動子區(qū)還發(fā)現(xiàn)了（GT）n微衛(wèi)星的多態(tài)性位點，并認為它們可通過影響DNA的構象來影響基因的轉錄和表達水平[33]。

3.3 雞SLC11A1基因多態(tài)與疾病的關聯(lián)

Hu等對雞SLC11A1基因與沙門氏傷寒菌感染的關聯(lián)進行研究，SLC11A1基因在易感系雞的編碼區(qū)存在11處突變，其中有3處是有益突變，而位于第69位（Arg→G1n）的突變只在傷寒沙門氏菌感染易感雞群中發(fā)現(xiàn)[34]。Girard-Santosuosso等對L2血清型的雞（312只）和13周齡的商品雞（373只）進行研究，將腸炎沙門氏菌靜脈注射進這些雞體內，試驗人員在3 d后分別對生殖器官、肝臟和脾臟含沙門氏菌的數(shù)量進行分析，試驗結果顯示，商品代雞SLC11A1基因的遺傳多態(tài)性引起內臟組織對腸炎沙門氏菌的抵抗力有遺傳上的差異[35]。Liu等在雞SLC11A1基因組水平上發(fā)現(xiàn)了37處SNPs（單核苷酸多態(tài)），并在2種來航雞的雜交后代公雞中發(fā)現(xiàn)，SLC11A1基因的SNPs與接種雞腸炎沙門氏（SE）疫苗后的抗體水平顯著相關（P<0.05）;在公雞的后代中，SLC11A1基因的SNPs突變數(shù)量與脾臟的細菌附著量顯著相關（P<005）。研究表明，SLC11A1基因高度保守區(qū)SNPs的多態(tài)與青年雞接種SE疫苗及病原致病菌攻擊后的免疫反應有相關性[36]。胡國順等分析2個雞種SLC11A1基因的SNPs與免疫性狀的相關性，在如皋雞和隱性白羽雞SLC11A1基因的第9個外顯子處發(fā)現(xiàn)了2處突變，在2個雞品種中，經過免疫功能和基因型的關聯(lián)分析，結果顯示，BB型和AB型要顯著高于AA型的H/L（異嗜性細胞與淋巴細胞比率），而AA型的淋巴細胞轉化率和IgM含量顯著高于BB型，說明該基因與免疫抗病性關聯(lián)，可以作為抗病育種的一個優(yōu)秀候選基因[37]。

3.4 豬SLC11A1基因多態(tài)與疾病的關聯(lián)

吳宏梅等采用PCR-RFLP方法分析了松遼黑豬和大白豬中SLC11A1基因多態(tài)位點，發(fā)現(xiàn)所研究的2個品種豬SLC11A1基因位于第6內含子的NdeⅠ酶切片段多態(tài)變異和豬中性粒細胞還原力與單核細胞的細胞毒作用百分率之間顯著相關[38]。劉艷冬等研究了香豬SLC11A1基因多態(tài)性與仔豬腹瀉的關系，基因型與腹瀉指數(shù)結果表明，不同品種豬表現(xiàn)出多態(tài)性不一，SLC11A1基因第6內含子區(qū)的變異影響免疫功能[39]。以上研究結果認為，豬的免疫功能受到SLC11A1基因遺傳多態(tài)性的影響，在豬分子抗病育種方面能夠起到一個主要候選基因的作用。

3.5 綿羊和山羊SLC11A1基因多態(tài)與疾病易感性和抗性的關聯(lián)

Matthews等研究發(fā)現(xiàn)，綿羊SLC11A1基因多態(tài)性與傷寒沙門氏菌易感性和抗性有關[40]。Worley等研究山羊SLC11A1基因外顯子10編碼的蛋白質表明，在第7和第8個跨膜結構域之間有2個糖基化位點，其中1個糖基化位點在多數(shù)反芻動物中是高度保守的，由第10外顯子的第16～24個堿基編碼，另1個糖基化位點在山羊和綿羊中這部分序列相似，與牛、野牛及赤鹿都有很大差異，由第58～66個堿基編碼。這些序列的保守性暗示了它在維持巨噬細胞和維護機體功能上的重要作用[41]。

3.6 狗SLC11A1基因與疾病易感性和抗性的關聯(lián)

Altet等發(fā)現(xiàn)狗的SLC11A1基因序列與狗對利什曼原蟲是否易感有關，發(fā)現(xiàn)的2處突變是在易感狗的SLC11A1基因序列中：外顯子11處的完全缺失和啟動子處富集G區(qū)[42]。Sanchez-Robert等對犬SLC11A1基因的研究發(fā)現(xiàn)，單倍型TAG-8-141與利什曼原蟲易感性有關[43]。

4 牛SLC11A1基因的變異及其功能

4.1 牛SLC11A1基因的結構與變異

Feng等首次報道牛SLC11A1基因全長為10 925 bp，開放閱讀框長1 647 bp，含有15個外顯子，編碼548個氨基酸;SLC11A1的氨基N端和羧基C端都位于細胞質內，在跨膜區(qū)（TMD）7和TMD8區(qū)域的細胞質外有1個糖基化位點，呈現(xiàn)環(huán)狀結構（loop），在TMD8和TMD9之間細胞質內含有1個由20個氨基酸組成的離子轉運基序（圖2），在不同物種間這個離子轉運基序高度保守[19]。SLC11A1蛋白N端含有多個磷酸化位點和SH3（Src基因同源性構域）結合位點。多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，不同品種家養(yǎng)牛和水牛SLC11A1基因第4、5內含子和第5外顯子分別有2、10、3個堿基點突變[21]。Xiao等報道，牛SLC11A1蛋白含有12個跨膜結構域[44]。

4.2 牛SLC11A1基因結構多態(tài)性與疾病的關聯(lián)

對奶牛的研究發(fā)現(xiàn)，3′UTR有微衛(wèi)星位點GT重復多態(tài)性，其中（GT）14純合子、雜合子（GT）13/（GT）14、（GT）13/（GT）15基因型具有遺傳易感性[45]，且（GT）13純合子基因型含有布氏桿菌遺傳抗性。有研究對荷斯坦奶牛與瘤?；蚪M進行比較表明，布魯氏菌的抗性和敏感性受不同基因型影響差異顯著，造成這些差異的原因是荷斯坦牛及瘤牛SLC11A1基因3′UTR區(qū)基因序列的遺傳多態(tài)性[20]。有研究從感染牛結核分枝桿菌的牛群中取樣，檢測SLC11A1基因表達量，發(fā)現(xiàn)病畜SLC11A1基因表達量較健康牛表達量顯著升高[46]。水牛SLC11A1基因3′UTR位點的多態(tài)性和布魯氏菌易感性有關，在2007年被Capparelli等發(fā)現(xiàn)，并揭示出抗性型水牛中巨噬細胞和單核細胞SLC11A1的表達量顯著高于敏感型水牛[47]。Ganguly等證實水牛SLC11A1基因3′UTR區(qū)GT重復多態(tài)與結核桿菌的抗性有關[48]。郭洋等研究了771頭中國荷斯坦牛SLC11A1基因第10外顯子、第9和第11內含子的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)不連鎖的4個SNPs分別為內含子9的6067（A/G）、6358（C/T），外顯子10的7155（A/G）和內含子11的7809（A/T）;其中，6067（A/G）、6358（C/T）和7809（A/T）為新SNPs[49]。乳腺炎的發(fā)病率和不同基因型的關聯(lián)性分析表明，SLC11A1基因的6358（C/T）和7155（A/G）對體細胞數(shù)和產奶量有顯著影響（P<0.05），初步證明這2個基因型是對疾病抗性比較優(yōu)良的基因型;單倍型分析結果表明，群體中共有16種單倍型的隨機組合，CAAA單倍型組合被初步確定是較優(yōu)良的單倍型，含有此單倍型的個體體細胞數(shù)低、產奶量高，可在奶牛乳腺炎的抗病育種篩選中作為候選基因標記[49]。Nam等應用定量PCR（RT-PCR）方法研究奶牛乳腺炎抗性與易感牛群外周血單核細胞中SLC11A1基因mRNA表達的不同，第1次報道出乳房炎抗性牛群SLC11A1基因mRNA的表達高于易感性牛群，乳腺炎高抗性?？梢罁?jù)這種差異被篩選出來[50]。

Bagheri等研究了135頭荷斯坦奶牛的SLC11A1基因結構和基因型的關系，發(fā)現(xiàn)該基因外顯子11上有1個位點突變，這個點突變構成的3個基因型都與荷斯坦奶牛的乳腺炎發(fā)病率顯著相關，此結果表明SLC11A1基因是一個與乳腺炎相關的抗病基因[51]。

Liu等在云南奶牛SLC11A1基因克隆及其抗結核的關聯(lián)研究中確認了該基因編碼蛋白抗結核的效果，通過克隆全部15個外顯子和14個內含子，分析136頭感染結核桿菌的荷斯坦牛和96頭未感染結核桿菌牛SLC11A1基因的多態(tài)，研究表明，SLC11A1基因的多態(tài)變異和結核桿菌發(fā)病率顯著相關[22]。

最近，西北農林科技大學的張涌教授團隊應用基因打靶編輯技術把SLC11A1基因插入牛的胎兒成纖維細胞，通過體細胞轉移，最終得到對結核桿菌病具有較強抵抗力的轉基因牛[6]，進一步表明SLC11A1基因是抗病育種研究中的一個重要候選基因。

5 展望

通過對小鼠、豬、雞、人、牛的研究系統(tǒng)表明，溶質載體轉運蛋白家族基因SLC11A1與結核桿菌、大腸桿菌等細菌抗性或易感性有關。SLC11A1基因比較保守，主要在肺臟、脾臟、血液外周白細胞等以及嗜中性粒細胞和巨噬細胞中表達，對動物的先天性免疫存在一定影響，對疾病的抗性具有非病原特異性，因此可以作為牛綜合抗病的良好候選基因之一。

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