利用LEAFYCOTYLEDON2轉(zhuǎn)錄因子提升植物營養(yǎng)器官內(nèi)油脂含量的研究綜述

薛金嫚 劉華 陳亞東

摘要：近年來，由于傳統(tǒng)油料作物種植耕地受限，在植物營養(yǎng)器官內(nèi)合成和儲存油脂已成為新的全球研究熱點。研究表明，在植物營養(yǎng)器官中通過基因工程手段調(diào)控參與種子中油脂合成的相關(guān)基因，會有效提升其甘油三脂含量和脂肪酸組成。LEAFY COTYLEDON 2（LEC2）是具有B3結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合蛋白家族的成員，參與調(diào)控胚胎發(fā)生、種子儲藏蛋白合成、脂肪酸代謝等重要生物學(xué)過程。近年來，許多研究都選擇該轉(zhuǎn)錄因子作為改造植物營養(yǎng)組織產(chǎn)油的關(guān)鍵因子，筆者對上述研究作了簡要的綜述，并探討了目前仍存在的問題和可能的解決對策。本文可為今后利用基因工程手段調(diào)控植物營養(yǎng)器官內(nèi)的油脂含量提供了一定的參考。

關(guān)鍵詞：LEC2;植物;營養(yǎng)器官;油脂合成

中圖分類號： S188 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）07-0011-03

隨著全球人口增加，工業(yè)化進(jìn)程加快，全球面臨食用油和化工原油短缺的嚴(yán)峻局面[1-2]。植物油脂除了提供人類及動物的營養(yǎng)，也普遍用于肥皂、表面活性劑、化妝品、涂料、潤滑油以及生物柴油的生產(chǎn)。在過去的半個世紀(jì)，人們通過各種嘗試來提高和改變油料作物的農(nóng)藝和品質(zhì)性狀[3-5]。近年來，由于氣候變化、環(huán)境污染、耕地受限，研究者逐漸認(rèn)識到僅利用油料作物的種子來生產(chǎn)植物油已難以滿足日益增長的市場需求[6]。在自然狀態(tài)下，葉片、莖稈等營養(yǎng)器官作為能量合成和運輸?shù)摹霸础逼鞴?，累積的中性油脂含量非常低下。僅在一些逆境脅迫條件下，植物營養(yǎng)組織內(nèi)會合成少量的油脂，但無法形成大量的累積。由于植物的營養(yǎng)組織具有生物量大、生長周期短、收獲指數(shù)高的優(yōu)點，近年來探索在植物營養(yǎng)組織內(nèi)合成和儲存油脂，作為傳統(tǒng)植物油生產(chǎn)體系的補充，已成為國外的研究熱點。目前一般從調(diào)控葉綠體內(nèi)脂肪酸合成、加強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上甘油三脂的組裝和促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)油滴形成這3個方面進(jìn)行研究，選擇改造上述過程中的1個（或多個）關(guān)鍵酶基因或轉(zhuǎn)錄因子。如在煙草幼苗中過表達(dá)擬南芥中的二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶基因（DGAT1），可使甘油三酯（TAG）含量增加至1%干質(zhì)量[7]，而在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中，TAG含量達(dá)到干質(zhì)量的 1.5%[8]。在擬南芥CGI58脂酶的突變體葉片中，TAG的含量可達(dá)到干質(zhì)量的0.03%～0.22%，同時亞油酸、亞麻酸等多不飽和脂肪酸含量升高[9-10]。而與此類似的是，在煙草內(nèi)共表達(dá)WRI1和DGAT對煙草葉片內(nèi)TAG的積累有協(xié)同作用[11]。而在擬南芥中過表達(dá)WRI1和DGAT可使其營養(yǎng)器官中TAG含量達(dá)到干質(zhì)量的2%～3%[12]。Kelly等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥SDP1脂酶突變體中共表達(dá)WRI1和DGAT基因，可以使葉片中的TAG含量達(dá)到干質(zhì)量的5%，根中TAG含量達(dá)到干質(zhì)量的8%[12]。上述研究表明，通過調(diào)控TAG合成過程中的1個或多個關(guān)鍵酶，植物營養(yǎng)器官完全可以作為產(chǎn)油和儲油的“工廠”來生產(chǎn)和累積油脂。

除了選擇油脂合成代謝的關(guān)鍵酶基因進(jìn)行改造以外，眾多研究者還選擇了不同來源的LEC2（LEAFY COTYLEDON2）轉(zhuǎn)錄因子來進(jìn)行改造。LEC2是一個具有B3結(jié)構(gòu)域的DNA結(jié)合蛋白，它參與調(diào)控了種子儲藏蛋白代謝、胚胎形成和脂肪酸代謝等重要生物學(xué)過程[13]。2004年，LEC2在擬南芥中被首次報道，過量表達(dá)AtLEC2，促進(jìn)了體細(xì)胞胚胎的形成，使轉(zhuǎn)基因植物營養(yǎng)組織出現(xiàn)了胚性發(fā)育現(xiàn)象。基因芯片數(shù)據(jù)還表明，AtLEC2能夠誘導(dǎo)下游大量參與合成儲藏蛋白、油體和脂肪酸的重要基因表達(dá)。最近研究還發(fā)現(xiàn)，LEC2對脂肪酸合成的調(diào)控作用，極有可能是通過調(diào)控AtWRI1轉(zhuǎn)錄因子來間接完成的[14-16]。通過分析近年來發(fā)表的文獻(xiàn)，將利用LEC2來改造植物營養(yǎng)組織含油量的研究分為兩大類，即單獨改變LEC2轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量的研究和組合表達(dá)LEC2轉(zhuǎn)錄因子的研究。

1 單獨過表達(dá)LEC2對植物營養(yǎng)組織油脂合成的影響

脂肪酸供應(yīng)是影響甘油三酯合成的主要因素[17]。在植物中，脂肪酸的合成發(fā)生在葉綠體中，其轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控被認(rèn)為是主要的調(diào)控途徑[18-19]。LEC2是參與調(diào)節(jié)脂肪酸合成的主要轉(zhuǎn)錄因子之一，近年常被用于提升并優(yōu)化植物種子內(nèi)的油脂含量和脂肪酸組成[20]。Mendoza等首次在擬南芥中過表達(dá)AtLEC2，發(fā)現(xiàn)在葉片內(nèi)積累了種子特異的mRNA，這些基因與甘油三酯的積累及油滴的形成密切相關(guān);與此同時，在含有蔗糖的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)LEC2表達(dá)的擬南芥第1個葉片的甘油三酯含量有所增加[21]，說明過表達(dá)LEC2可提升營養(yǎng)組織內(nèi)的油脂含量。有趣的是，Slocombe等分析了3～4周齡、生長在土壤中的過表達(dá)AtLEC2擬南芥植株的葉片油脂含量，結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)其甘油三酯含量明顯低于野生型[22]。上述差異可能是由培養(yǎng)基中的碳源供給不同而造成的，暗示著LEC2驅(qū)動的營養(yǎng)組織內(nèi)的油脂合成需要充足和穩(wěn)定的碳水化合物供給。

另外，由于LEC2參與了植物的胚性發(fā)育，而組成型過表達(dá)LEC2的轉(zhuǎn)基因植株，往往出現(xiàn)生長緩慢、葉片卷曲的表型。Kim等在擬南芥中用35S強(qiáng)啟動子驅(qū)動過表達(dá)來自蓖麻的LEC2轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥中的TAG含量分別達(dá)到了野生型的2.8倍（283 ng/mg）。但是，與此同時，轉(zhuǎn)基因植株卻出現(xiàn)了組織扭曲變形的體細(xì)胞胚胎發(fā)生現(xiàn)象，嚴(yán)重影響到了轉(zhuǎn)基因植株的光合作用和生物量累積[23]。由于35S啟動子是一個組成型表達(dá)的強(qiáng)啟動子，因此對于所驅(qū)動的基因會非選擇性地進(jìn)行強(qiáng)行表達(dá)，而在自然狀態(tài)下，LEC2的表達(dá)不可能是組成型的。有趣的是，選擇不同的啟動子，對于LEC2的表達(dá)效果和植株表型也會產(chǎn)生截然不同的影響。Andrianov等在煙草葉片中用AIC作為啟動子，在成熟葉片中用乙醛誘導(dǎo)了AtLEC2的表達(dá)，結(jié)果表明，AtLEC2的表達(dá)使煙草葉片中總的脂肪酸含量達(dá)到干重的6.8%，但表型卻沒有發(fā)生明顯的改變[24]。Nookaraju等在煙草莖稈中以PtdCesA8A為啟動子，過表達(dá)擬南芥的AtLEC2，使莖稈中的含油率達(dá)到2%，轉(zhuǎn)基因煙草的表型同樣沒有受到影響[25]。Kim等用衰老誘導(dǎo)啟動子在擬南芥中過表達(dá)AtLEC2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葉片內(nèi)WRI1表達(dá)量上升，轉(zhuǎn)基因植株TAG含量達(dá)到干質(zhì)量的1.4%，與野生型相比提高了3倍，但是植株表型未發(fā)生任何改變，其生長沒有受到明顯的抑制[26]（表1）。上述結(jié)果表明，不同的啟動子，對LEC2的表達(dá)和功能具有不同的調(diào)控作用。

最后，在不同的受體物種中，過表達(dá)LEC2轉(zhuǎn)錄因子，其產(chǎn)生的效果也有差異。如用35S強(qiáng)啟動子驅(qū)動擬南芥AtLEC2在小球藻內(nèi)過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)AtLEC2基因藻株的脂肪酸含量比原始藻株提高了1倍以上，且對小球藻的生長及光合作用沒有產(chǎn)生明顯影響[27]。

2 共表達(dá)LEC2和其他基因?qū)χ参餇I養(yǎng)組織內(nèi)油脂含量的影響 ?在種子中，僅通過控制油脂代謝途徑中單一的酶促反應(yīng)已被證明并不能顯著影響種子內(nèi)的油脂合成與儲存[28]。單獨過表達(dá)LEC2的轉(zhuǎn)基因策略對植物營養(yǎng)組織或藻類的油脂合成具有促進(jìn)作用，但是由于植物油脂合成是一個極其復(fù)雜的過程，涉及到各種不同功能的酶在代謝途徑中的分工合作，共同調(diào)控著油脂的合成與累積，因此組合LEC2與其他基因進(jìn)行共表達(dá)，理論上可以更進(jìn)一步提升轉(zhuǎn)基因植株的油脂含量。近年來，越來越多的研究者嘗試將油脂合成（降解）代謝途徑中的多個關(guān)鍵酶基因（轉(zhuǎn)錄因子）進(jìn)行組合表達(dá)（或敲除），以此來提高植物營養(yǎng)器官中的油脂含量。目前的研究主要從以下3個層面入手：（1）在葉綠體內(nèi)提高光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為脂肪酸的效率;（2）增加內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脂肪酸組裝成甘油三酯的效率;（3）降低脂酶活性，防止脂肪酸或油體的降解[5-6，29-30]。其中，調(diào)控葉綠體內(nèi)脂肪酸合成的LEC2已被選擇與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上甘油三脂組裝、胞質(zhì)內(nèi)油滴形成的多個基因進(jìn)行組合并串聯(lián)表達(dá)（表1）。Slocombe等在擬南芥中過表達(dá)AtLEC2，擬南芥在葉片處于衰老期時甘油三酯積累量達(dá)到最大值，為干質(zhì)量的0.8%，但是脂肪酸降解突變體cts2與過表達(dá)AtLEC2植株雜交后代油脂分析顯示，其甘油三酯含量與cts2單突變體相比并沒有明顯增加;類似地在過氧化物酶體pxa1突變體中過表達(dá)AtLEC2，結(jié)果表明，在葉片進(jìn)入衰老期時擬南芥葉片中的甘油三酯含量與擬南芥pxa1突變體相比也并沒有明顯增加[22]。這可能是因為當(dāng)葉片處于衰老期時，二者都能利用膜脂降解過程產(chǎn)生的脂肪酸以避免其進(jìn)入氧化途徑，因此選擇適當(dāng)?shù)幕蚪M合也是十分必要的。Londo等在煙草中共表達(dá)WRI1、DGAT1及OLEOSIN，結(jié)果表明，根、莖中的甘油三酯含量都有所提高，處于衰老時期葉片的TAG含量達(dá)到干質(zhì)量的15%，并且對植株生長沒有產(chǎn)生明顯的影響[31]。Li等又進(jìn)一步在共表達(dá)WRI1、DGAT1及Oleosin的煙草葉片中過表達(dá)AtLEC2，使葉片中的TAG含量達(dá)到干質(zhì)量的30%[32]，這個數(shù)值已非常接近植物種子內(nèi)的油脂水平。更重要的是，在上述轉(zhuǎn)基因植株中，并未表現(xiàn)出明顯的不良生長狀況。值得注意的是，在上述研究中，轉(zhuǎn)基因植株營養(yǎng)組織內(nèi)積累的油脂分布并不均勻，呈現(xiàn)出較大的時空差異，即葉齡較大的葉片中的油脂含量高于幼年葉片，這可能是因為油脂的合成和累積需要時間，且衰老葉片內(nèi)相關(guān)酶的表達(dá)量也較高。處于植株上部位置的葉片油脂含量高于植株下部位置葉片的油脂含量，這可能與維管束的運輸、淀粉的降解、糖酵解的空間區(qū)隔化有關(guān)。而筆者前期研究也發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)AtLEC2煙草的植株，成年葉片上會出現(xiàn)比較明顯的葉片斑塊化現(xiàn)象，一些葉片部位呈現(xiàn)出非枯死性的白色斑塊區(qū)域，暗示著這些部位的葉綠體發(fā)育已受到明顯影響，這可能與過表達(dá)AtLEC2會驅(qū)動脂肪酸進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)參與甘油三酯組裝，而非進(jìn)入葉綠體參與膜脂重建有關(guān)。所以，在對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行油脂含量分析時，取樣時期和取樣部位的選擇至關(guān)重要。

3 展望

植物油脂的合成是一個極其復(fù)雜的過程，在植物營養(yǎng)組織內(nèi)合成和儲存油脂，從概念的提出到實驗室獲得30%葉片含油量的轉(zhuǎn)基因煙草株系，只用了不到10年時間，相關(guān)領(lǐng)域的研究已如火如荼。LEC2轉(zhuǎn)錄因子雖然已被證明可以有效提高植物（藻類）營養(yǎng)器官和種子內(nèi)的油脂含量，但是，其效果在不同的宿主植物和啟動子之間存在較大的差異，甚至在一些轉(zhuǎn)基因植株還出現(xiàn)了生長緩慢、葉片扭曲變形的胚性發(fā)育現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了植株的正常生長。因此，選擇哪些宿主植物？選擇什么啟動子和結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行組合？在植物哪些部位進(jìn)行表達(dá)？表達(dá)量控制到多少才能平衡油脂產(chǎn)量和植物正常生長？這些問題還有待進(jìn)一步的研究闡明。對LEC2調(diào)控營養(yǎng)組織油脂含量的研究，有助于研發(fā)新型的油脂生產(chǎn)體系，因此具有十分重要的理論和實踐意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]Carlsson A S，Yilmaz J L，Green A G，et al. Replacing fossil oil with fresh oil - with what and for what？[J]. European Journal of Lipid Science and Technology，2011，113（7）：812-831.

[2]Thelen J J，Ohlrogge J B. Metabolic engineering of fatty acid biosynthesis in plants[J]. Metabolic Engineering，2002，4（1）：12-21.

[3]Reynolds K B，Taylor M C，Zhou X，et al. Metabolic engineering of medium-chain fatty acid biosynthesis in Nicotiana benthamiana plant leaf lipids[J]. Frontiers in Plant Science，2015，6：164.

[4]Ohlrogge J B. Design of new plant products：engineering of fatty acid metabolism[J]. Plant Physiology，1994，104（3）：821-826.

[5]Hu Q，Sommerfeld M，Jarvis E，et al. Microalgal triacylglycerols as feedstocks for biofuel production：perspectives and advances[J]. The Plant Journal，2008，54：621-639.

[6]Radakovits R，Jinkerson R E，Darzins A A. Genetic engineering of algae for enhanced biofuel production[J]. Eukaryotic Cell，2010，9（4）：486-501.

[7]Wu H Y，Liu C，Li M C，et al. Effects of monogalactoglycerolipid deficiency and diacylglycerol acyltransferase overexpression on oil accumulation in transgenic tobacco[J]. Plant Molecular Biology Reporter，2013，31（5）：1077-1088.

[8]Bouvier-Navé P，Benveniste P，Oelkers P，et al. Expression in yeast and tobacco of plant cDNAs encoding acyl CoA：diacylglycerol acyltransferase[J]. European Journal of Biochemistry，2000，267（1）：85-96.

[9]Park S，Gidda S K，James C N，et al. The α/β hydrolase CGI-58 and peroxisomal transport protein PXA1 coregulate lipid homeostasis and signaling in Arabidopsis[J]. Plant Cell，2013，25（5）：1726-1739.

[10]James C N，Horn P J，Case C R，et al. Disruption of the Arabidopsis CGI-58 homologue produces chanarin-dorfman-like lipid droplet accumulation in plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2010，107（41）：17833-17838.

[11]Vanhercke T，El Tahchy A，Shrestha P，et al. Synergistic effect of WRI1 and DGAT1 coexpression on triacylglycerol biosynthesis in plants[J]. FEBS Letters，2013，587（4）：364-369.

[12]Kelly A A，van Erp H，Quettier A L，et al. The SUGAR-DEPENDENT1 lipase limits triacylglycerol accumulation in vegetative tissues of Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2013，162（3）：1282-1289.

[13]Angeles-Núez J G，Tiessen A. Mutation of the transcription factor LEAFY COTYLEDON 2 alters the chemical composition of Arabidopsis seeds，decreasing oil and protein content，while maintaining high levels of starch and sucrose in mature seeds[J]. Journal of Plant Physiology，2011，168（16）：1891-1900.

[14]Cernac A，Andre C，Hoffmann-Benning S，et al. WRI1 is required for seed germination and seedling establishment[J]. Plant Physiology，2006，141（2）：745-757.

[15]Liu J，Hua W，Zhan G，et al. Increasing seed mass and oil content in transgenic Arabidopsis by the overexpression of wri1-like gene from Brassica napus[J]. Plant Physiology and Biochemistry，2010，48（1）：9-15.

[16]Baud S，Mendoza M S，To A，et al. WRINKLED1 specifies the regulatory action of LEAFY COTYLEDON2 towards fatty acid metabolism during seed maturation in Arabidopsis[J]. The Plant Journal for Cell and Molecular Biology，2007，50（5）：825-838.

[17]Bourgis F，Kilaru A，Cao X，et al. Comparative transcriptome and metabolite analysis of oil palm and date palm mesocarp that differ dramatically in carbon partitioning[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2011，108（30）：12527-12532.

[18]Ohlrogge J B，Jaworski J G. Regulation of fatty acid synthesis[J]. Annual Review of Plant Biology，1997，48：109-136.

[19]Millar A A，Smith M A，Kunst L. All fatty acids are not equal：discrimination in plant membrane lipids[J]. Trends in Plant Science，2000，5（3）：95-101.

[20]Baud S，Lepiniec L. Regulation of de novo fatty acid synthesis in maturing oilseeds of Arabidopsis[J]. Plant Physiology & Biochemistry，2009，47（6）：448-455.

[21]Mendoza M S，Dubreucq B，Miquel M，et al. LEAFY COTYLEDON 2 activation is sufficient to trigger the accumulation of oil and seed specific mRNAs in Arabidopsis leaves[J]. FEBS Letters，2005，579（21）：4666-4670.

[22]Slocombe S P，Cornah J，Pinfield-Wells H，et al. Oil accumulation in leaves directed by modification of fatty acid breakdown and lipid synthesis pathways[J]. Plant Biotechnology Journal，2009，7（7）：694-703.

[23]Kim H U，Jung S J，Lee K R，et al. Ectopic overexpression of castor bean LEAFY COTYLEDON2 （LEC2） in Arabidopsis triggers the expression of genes that encode regulators of seed maturation and oil body proteins in vegetative tissues[J]. FEBS Open bio，2014，4（1）：25-32.

[24]Andrianov V，Borisjuk N，Pogrebnyak N A，et al. Tobacco as a production platform for biofuel：overexpression of Arabidopsis DGAT and LEC2 genes increases accumulation and shifts the composition of lipids in green biomass[J]. Plant Biotechnology Journal，2010，8（3）：277-287.

[25]Nookaraju A，Pandey S K，F(xiàn)ujino T，et al. Enhanced accumulation of fatty acids and triacylglycerols in transgenic tobacco stems for enhanced bioenergy production[J]. Plant Cell Reports，2014，33（7）：1041-1052.

[26]Kim H U，Lee K R，Jung S J，et al. Senescence-inducible LEC2 enhances triacylglycerol accumulation in leaves without negatively affecting plant growth[J]. Plant Biotechnology Journal，2015，13（9）：1346-1359.

[27]劉長斌，佟少明，張文蕾，等. 擬南芥Leafy Cotyledon 2的表達(dá)提高了小球藻Chlorella sorokiniana的油脂含量[J]. 生物工程學(xué)報，2017，33（6）：1037-1045.

[28]Ramli U S，Baker D S，Quant P A，et al. Control analysis of lipid biosynthesis in tissue cultures from oil crops shows that flux control is shared between fatty acid synthesis and lipid assembly[J]. Biochemical Journal，2002，364（2）：393-401.

[29]Greenwell H C，Laurens L M，Shields R J，et al. Placing microalgae on the biofuels priority list：a review of the technological challenges[J]. Journal of the Royal Society Interface，2010，7（46）：703-726.

[30]苗迎春，雷 潔，牛蕾蕾，等. 提高植物營養(yǎng)器官含油量的研究進(jìn)展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（1）：1-5.

[31]Kondo H，Shiratsuchi K，Yoshimoto T，et al. Acetyl-CoA carboxylase from Escherichia coli：gene organization and nucleotide sequence of the biotin carboxylase subunit[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1991，88：9730-9733.

[32]Li S J，Cronan J E Jr. The gene encoding the biotin carboxylase subunit of Escherichia coli acetyl-CoA carboxylase[J]. Journal of Biological Chemistry，1992，267（2）：855-863. 曾祥朋，楊清香. 噬菌體在環(huán)境耐藥基因轉(zhuǎn)移中的作用綜述[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（7）：14-18.