二尖瓣退行性變相關分子信號通路的研究進展

劉良，劉曉紅，徐志云

(第二軍醫(yī)大學長海醫(yī)院，上海200433)

二尖瓣退行性變(DMVD)又稱為二尖瓣黏液變性或二尖瓣脫垂綜合征，是一種常見的心臟瓣膜病，在美國和西方發(fā)達國家，DMVD已成為引起二尖瓣關閉不全的最主要的原因。DMVD在人和犬兩個物種均與年齡強相關，因此被認為是一種退行性疾病[1]。與DMVD相關的病理變化包括蛋白多糖過度沉積、彈性蛋白破碎、膠原蛋白破壞中斷，這些變化將導致瓣葉明顯增厚、瓣膜結構脆弱、瓣葉和腱索過度伸長，導致瓣葉膨出、脫垂或松弛，誘發(fā)腱索斷裂。近年來隨著相關研究的不斷深入，學術界逐漸認識到DMVD是一種具有可識別信號機制以控制關鍵效應蛋白表達的疾病，而非不可避免的衰老過程。提高對DMVD相關信號傳導通路的認識有助于臨床工作者確定治療策略。現(xiàn)將近年來DMVD相關信號傳導通路的研究進展綜述如下。

1 心臟瓣膜的結構

心臟瓣膜結構在脊椎動物中高度保守。成人心臟瓣膜葉片為三層分層結構，依血流方向，分別為內(nèi)層的心房面(房室瓣中)和 室肌面(半月瓣中)，中層的海綿層以及外層的纖維層。在房室瓣，纖維層與腱索延續(xù)。各層細胞外基質(zhì)的組成被認為反映了心臟瓣膜應對主要生物機械應力的功能定位。纖維層主要由環(huán)向取向的膠原蛋白纖維束組成，故瓣葉最外層呈波紋狀，瓣葉在心臟舒張時能得到最大的舒展；海綿層主要成分為氨基葡聚糖，可吸收水分，使海綿層膨脹，以吸收瓣葉運動時所產(chǎn)生的沖擊力，起到很好的緩沖作用，同時其亦是三層中細胞密度最低的一層；內(nèi)層富含徑向彈性蛋白，以應對瓣膜開放時血流側的剪切力，使得瓣葉能夠重復地開啟閉合，同時也為纖維層提供反沖張力，使纖維層在伸展狀態(tài)下能夠恢復波紋形狀，為下次的運動循環(huán)做準備。

心臟瓣膜的細胞主要由瓣膜內(nèi)皮細胞(VEC)、平滑肌細胞和瓣膜間質(zhì)細胞(VIC)組成。VEC覆蓋瓣葉表面，CD31陽性，與血管內(nèi)皮細胞功能相同。平滑肌細胞在近瓣葉血流側薄層分布，可由平滑肌重鏈肌球蛋白的表達識別和定位。VIC為成纖維間葉細胞，其主要功能為通過不斷合成和降解來維持細胞外基質(zhì)組成。VIC在維持瓣膜功能及應對瓣膜終生承受的生物力學載荷中起到關鍵作用。鑒于瓣膜退變的根本是細胞外基質(zhì)的失衡，心臟瓣膜退行性變的細胞介質(zhì)首選VIC。Rabkin等[2]首次研究了“靜態(tài)”VIC向“激活的肌成纖維細胞”的表型轉化，發(fā)現(xiàn)VIC在人退行性二尖瓣中表達肌成纖維細胞骨架成分α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和結蛋白以及間充質(zhì)活化的標志物——非肌肉型肌球蛋白重鏈，并進一步證實激活的肌成纖維細胞增加基質(zhì)分解代謝酶的表達，包括膠原酶(基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-1和-13)、明膠酶(MMP-2和9)、彈性蛋白酶(組織蛋白酶K)。Disatian 等[3]亦證明了在犬DMVD的間質(zhì)細胞中，α-SMA、結蛋白、非肌肉型肌球蛋白重鏈有著幾乎同樣的表達模式。如今普遍認為，VIC的表型轉化與心臟瓣膜的病理變化密切相關。

2 DMVD的啟動機制

化學和機械刺激均可觸發(fā)相關分子信號通路，這些分子信號通路通過激活轉錄因子轉而控制基因表達。

2.1 化學刺激 化學刺激源可能包括循環(huán)血液中血漿中的物質(zhì)或心瓣膜附近的循環(huán)血細胞所釋放的物質(zhì)，其中循環(huán)血清素受到廣泛關注。研究證實，與類癌綜合征(腸嗜鉻細胞瘤)相關的循環(huán)高血清素可誘導人類心臟瓣膜病。血清素導致心臟瓣膜病的機制與退行性心臟瓣膜病不同，但二者均以黏液變性為主，即與蛋白聚糖/蛋白多糖過度沉積相關。但由于血小板快速去除或通過肝和肺的細胞代謝，血漿中循環(huán)血清素水平通常很低，只有在血清素合成遠遠超過清除時，如在類癌綜合征中，循環(huán)血清素水平才高到足以引起瓣膜病。當發(fā)生這種情況時，右心瓣膜首先受影響，原因在于血清素通過肺部清除。通過血小板釋放而非依賴循環(huán)水平血清素，其生物學意義尚不清楚。 更多的生物學可能的是外源性血清素和其他化學刺激物可以通過血小板傳遞至心臟瓣膜。犬和人退行性二尖瓣表面均可通過電子顯微鏡掃描觀察到內(nèi)皮細胞剝蝕和血小板黏附[4]，內(nèi)皮細胞剝蝕推測與二尖瓣反流相關的湍流模式引起。因此，對于DMVD，血小板黏附和釋放化學刺激更表現(xiàn)為一個持續(xù)的過程而非觸發(fā)的機制。

2.2 機械刺激 VIC通過重塑其細胞外基質(zhì)來應對機械刺激。鑒于DMVD的根本是細胞外基質(zhì)動態(tài)平衡失調(diào)，因此生物力學異常載荷可能是退行性瓣膜病的啟動機制之一。加載于心臟瓣膜的生物機械力包括牽拉、剪切、壓縮和彎曲[5]，任一或所有這些外力均可參與DMVD發(fā)病機制。高張力在退行性瓣膜病發(fā)病機制中可能發(fā)生的作用已受到廣泛關注。高血壓和遺傳性結締組織疾病(例如馬凡綜合征)是已知的人DMVD危險因素[6]。二者均可被認為增加了VIC的拉伸應變。有體外實驗支持了拉伸應變作為DMVD啟動機制的作用，Lacerda等[7]報道，與未處理組比較，犬二尖瓣通過靜態(tài)或循環(huán)拉伸應變增加了α-SMA、肌球蛋白、膠原酶、組織蛋白酶K、木糖轉移酶(糖胺聚糖合成酶)以及核心蛋白聚糖的表達。一個羊體內(nèi)實驗證實接近二尖瓣的湍流可誘發(fā)黏液變性[8]。這個實驗支持異常剪切力在DMVD發(fā)生、發(fā)展中的作用，也同時論證了一個一直持有的理論:二尖瓣反流導致了更嚴重的二尖瓣反流。如果張力和剪切力在DMVD發(fā)病機制中起到啟動和推動作用，關于啟動退行性瓣膜病信號通路的具體的力學感受器和機械傳導機制卻尤未可知?？紤]到VIC與細胞外基質(zhì)的密切關系，VIC是邏輯上的張力傳感細胞，而VEC響應剪切應力，因此VEC應有探測剪切應力的力學感受機制。

3 DMVD相關分子通路

3.1 血清素 血清素的合成由其限速酶色氨酸羥化酶(TPH)控制。TPH的兩個亞型已經(jīng)明確，周圍神經(jīng)系統(tǒng)亞型TPH1和中樞神經(jīng)系統(tǒng)亞型TPH2。約95%的周圍型血清素是由嗜鉻細胞在腸內(nèi)合成。血清素通過7個不同的血清素受體家族發(fā)揮作用，除一個以外，均屬于Gp蛋白偶聯(lián)受體超家族激活磷酸脂酶C。MAP激酶(一種細胞外信號調(diào)節(jié)激酶)是血清素的下游信號并介導其促進細胞增殖效果。血清素介導的細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)磷酸化(ppERK)已在數(shù)種細胞中被發(fā)現(xiàn)，其誘導有絲分裂是依賴Rho激酶介導的ppERK核易位。血清素活性由血清素轉運體經(jīng)細胞攝取血清素方式終止，隨后經(jīng)單胺氧化酶代謝或存儲于血小板。

高循環(huán)血清素或血清素藥物可在人和大鼠誘發(fā)瓣膜病。在類癌綜合征(嗜鉻細胞瘤功能)，血漿血清素水平最高的患者發(fā)生瓣膜病的風險也最高[9]。右心瓣膜通常最受影響，原因在于血清素通過肺部清除。類癌瓣膜病被描述為瓣膜表面斑塊形成，病理特征為成纖維細胞增殖，纖維化和黏液基質(zhì)沉積[9]。研究發(fā)現(xiàn)，長期血清素注射的大鼠發(fā)生形態(tài)和功能類似的瓣膜病[10]；一些藥物，包括芬氟拉明和麥角衍生藥物，與心臟瓣膜病有關，尤其是二尖瓣病變[11]。如今的證據(jù)強烈提示血清素2B受體(5HT2BR)的特異性激活是血清素源性瓣膜病的發(fā)病機制[11]。血清素轉運受體(SERT)敲除小鼠出現(xiàn)心臟瓣膜病原因考慮為心臟瓣膜中有效血清素增加。盡管血清素源性黏液變性與DMVD病變相似，但血清素在DMDV的發(fā)病機理中的直接作用尚未明確。

Oyama等[12]首次報道犬DMVD中5HT2BR轉錄水平上升。亦有報道在犬DMVD中5HT2BR蛋白豐度上升而SERT蛋白豐度下降，而ppERK升高并未改變ERK總量，與活躍的血清素信號一致[13]。重要的是，人和犬DMVD中TPH1表達升高數(shù)倍，在狗疾病早期和晚期TPH1表達均有上升，符合血清素可能是DMVD啟動因素的理論[3, 13]?；谶@些發(fā)現(xiàn)，有假說認為，DMVD是由局部血清素信號機制所介導的。Disatian等[3, 13]報道了靜態(tài)和循環(huán)拉伸應變誘導培養(yǎng)的犬二尖瓣TPH1表達升高，局部血清素合成增加，并發(fā)現(xiàn)抑制TPH1或5HT2BR可減弱黏液變性效應蛋白在羊二尖瓣的表達。Cremer等[14]在豬體內(nèi)實驗中證實二尖瓣反流引起血清素受體相關基因表達增高，而TPH1和SERT 表達降低。這些研究支持DMVD患者的血清素水平升高是由于拉伸應變導致的。

3.2 轉化生長因子β(TGF-β) TGF-β屬于生長因子超家族，包括TGF-β的亞型TGF-β1～3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、活化素和抑制素[15]。TGF-β是由2個分子量為1 215 kD的亞基通過二硫鍵連接成具有生物活性的同源二聚體。其超家族根據(jù)其序列同源性和所激活的信號通路的不同分為兩個亞家族:TGF-β/Activin/Nodal亞家族和BMP/GDF/MIS亞家族。哺乳動物主要有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3共3種形式。TGF-β信號分子通過跨膜的受體復合物進行信號轉導,這些受體(TGF-βR)根據(jù)分子量大小可分為三型。Ⅰ型(50～60 kD)也稱ALKs,包括7種；Ⅱ型(75～80 kD)包括5種；Ⅲ型(280 kD)。Ⅰ、Ⅱ型受體屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶家族,Ⅱ型受體能以較高的親和力與TGF-β2配體結合,并與Ⅰ型受體形成異源受體復合物,將Ⅰ型受體近膜的一段富含甘氨酸、絲氨酸殘基的區(qū)域(GS結構域)磷酸化啟動胞內(nèi)信號級聯(lián)反應。TGF-β超家族的二聚配體與細胞膜表面的Ⅰ型和Ⅱ型受體具有高度的親和力,結合形成異四聚體。在該復合物中,Ⅱ型受體在自主磷酸化同時可將Ⅰ型受體GS結構域磷酸化而激活,活化的TGF-βRⅠ使R2SmadSSxS區(qū)域兩個絲氨酸殘基磷酸化并與Smad4結合形成異三聚或四聚體進入胞核,與許多輔助活化因子和輔助抑制因子協(xié)同作用調(diào)節(jié)靶基因的轉錄[15, 16]。

TGF-β1過表達與幾個心臟疾病有關，包括類癌性心臟病、鈣化性主動脈瓣狹窄、風濕性心臟病等，其突出特征為纖維化[16]。研究證實，TGF-β亞型在犬退行性二尖瓣中強過表達，TGF-βRⅠ和RⅡ豐度亦有增高[13]；在體外培養(yǎng)的豬主動脈中，TGF-β1和15%的循環(huán)應變協(xié)同增加α-SMA表達和膠原合成[17]；TGF-β1在體外培養(yǎng)的VIC誘導糖胺聚糖合成[18]。而體外培養(yǎng)綿羊主動脈VIC中，血清素通過GP信號通路增加TGF-β1mRNA表達[18]。這些研究提示了一個在血清素信號、TGF-β信號和黏液變性效應基因及蛋白表達之間的功能聯(lián)系。

3.3 發(fā)育調(diào)控信號通路 心臟瓣膜生成在脊椎動物中高度保守，并由發(fā)育調(diào)控通路調(diào)節(jié)，由基于受體的信號轉導、轉錄因子及下游結構基因組成[19]。發(fā)育調(diào)控通路調(diào)節(jié)瓣膜生成，同時引導彈性大動脈、軟骨、骨和腱的發(fā)展。被認為參與瓣膜發(fā)育最后階段的具體通路包括[19]、Notch 1、BMP-Sox9信號通路、Wnt信號通路、FGF4信號通路。

3.3.1 BMP-Sox9 信號通路 Sox9是Y染色體性別決定基因相關高移動框轉錄因子。BMPs是TGF-β超家族的成員。BMPs通過Smad磷酸化與TGF-β直接關聯(lián)[15]，其在發(fā)育和出生后的軟骨形成中通過激活轉錄因子Sox9發(fā)揮作用[20]。Sox 9活化介導軟骨聚集和軟骨特異性結構基因包括蛋白聚糖、Ⅱ型膠原、軟骨連接蛋白和N-鈣黏蛋白的表達[20]。BMP2在發(fā)展中的心臟瓣膜祖細胞中誘導Sox9和蛋白聚糖表達[21]。BMP2被認為在瓣膜分層時海綿層發(fā)育中發(fā)揮作用[19]。Sox9在人退行性二尖瓣病變中已有報道，但與正常二尖瓣比較其表達是否增加尚不清楚。鑒于軟骨和黏液變性瓣膜病理形態(tài)相似性， BMP-Sox 9信號作為調(diào)控DMVD的候選信號通路是符合邏輯的。已有初步證據(jù)證明，犬和人退行性二尖瓣中Sox9、軟骨聚集蛋白聚糖及軟骨特異性II型膠原的局灶共存表達[22]。可以推論，退行性二尖瓣具有Sox9信號影響下形成的軟骨灶。

3.3.2 Wnt 信號通路 Wnt信號通路廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類在物種進化過程中高度保守的信號通路。Wnt信號在動物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、組織再生和其他生理過程中具有至關重要的作用。WNT信號通路調(diào)控胚胎發(fā)育及產(chǎn)后軟骨疾病過程、成骨過程及軟骨內(nèi)成骨和骨密度特性[23]，Wnt3a和5a配體介導軟骨形成，而其他配體介導骨形成。人類LRP-5基因突變致功能喪失或增益分別導致青少年骨質(zhì)疏松和高骨質(zhì)量綜合征[24]。有研究表明，LRP-5通過抑制TPH1和嗜鉻細胞合成血清素調(diào)節(jié)骨形成，血清素又直接抑制成骨[25]；LRP-5-Wnt-βcatenin信號通路與人退行性(鈣化性)主動脈瓣疾病相關[26]。筆者根據(jù)上述研究結果提出一個設想，退行性瓣膜病包括一個病理過程，表現(xiàn)為退行性(鈣化性)主動脈瓣中骨生成和退行性(黏液變性)二尖瓣中軟骨生成。鑒于血清素可抑制成骨，筆者推測在二尖瓣局部合成的血清素可起到抑制成骨而促進軟骨形成的作用。

3.3.3 Notch信號通路 Notch信號通路廣泛存在于脊椎動物和非脊椎動物，進化上高度保守，通過相鄰細胞之間的相互作用調(diào)節(jié)細胞、組織、器官的分化和發(fā)育。哺乳動物有4種Notch受體(Notch1～4)和5種Notch配體。Notch受體為單向跨膜蛋白，分胞內(nèi)區(qū)和胞外區(qū)。Notch配體蛋白與胞外區(qū)結合，并誘導蛋白裂解為2個片段，N端裂解產(chǎn)物(胞外區(qū))被配體表達細胞吞噬，而C端裂解產(chǎn)物進一步移動到細胞核調(diào)控下游基因表達，從而促進細胞增殖和抑制細胞分化。相鄰細胞可以通過Notch受體與配體的結合傳遞Notch信號，從而擴大并固化細胞間的分子差異，最終決定細胞命運，影響器官形成和形態(tài)發(fā)生。Notch信號是相鄰細胞之間通訊進而調(diào)控細胞發(fā)育的重要通路。

Notch信號在早期心臟瓣膜發(fā)育上皮-間充質(zhì)過渡階段發(fā)揮作用[19, 27]。Notch信號被猜測在心臟瓣膜發(fā)育后期分層階段通過探測瓣膜血流側剪切應力發(fā)揮作用。Notch信號局部激活，因而建立瓣膜極性，并在房室層發(fā)育中發(fā)揮關鍵作用[19]。Notch信號突變與先天性主動脈瓣二葉畸形和成人退行性(鈣化性)主動脈瓣疾病有關聯(lián)[27]，但與DMVD無關， Notch信號可能通過VEC探測異常剪切應力，但尚未被證實。

3.4 一氧化氮(NO) 內(nèi)皮細胞NO信號由鈣/鈣調(diào)蛋白調(diào)控的內(nèi)皮型NOS介導。釋放NO激活靶細胞溶解形態(tài)的鳥苷酸環(huán)化酶，反過來產(chǎn)生cGMP， cGMP通過激活cGMP依賴蛋白激酶發(fā)揮作用。內(nèi)皮細胞釋放NO由內(nèi)源性血管擴張劑通過特定受體(如乙酰膽堿、緩激肽)和血流引起的剪切應力調(diào)控。已經(jīng)證明孤立的豬二尖瓣釋放NO[28]。豬血管內(nèi)皮細胞釋放NO依賴鈣離子內(nèi)流和內(nèi)皮型NOS激活。ADP和凝血酶、緩激肽可增加其釋放。在輕度黏液變性的豬二尖瓣中證實NO釋放和內(nèi)皮型NOS、誘導型NOS表達增加[29]。NOS活性與VEC相關，且與病理改變最大區(qū)域強烈相關。這些研究證實了DMVD中內(nèi)皮型NOS活性和NO釋放增加，但是是否NO介導了病理基因表達還是僅僅是對反流引起的亂流的應答尚無定論；NO在DMVD發(fā)病機制中的作用有待進一步研究。

3.5 血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ) AngⅡ是由血管緊張素Ⅱ轉化酶轉化AngI獲得的一種多肽激素，通過Ⅰ型AngⅡ受體(AT1受體)調(diào)節(jié)細胞功能。AT1受體是G蛋白偶聯(lián)受體，通過激活磷脂酶C和第二信使：三磷酸肌醇和蛋白激酶C發(fā)揮作用。AngⅡ參與了退行性二尖瓣反流相關的充血性心力衰竭的發(fā)生。亦有證據(jù)顯示AngⅡ在人和犬心室重構中發(fā)揮作用。在人體外培養(yǎng)VIC觀察到血管緊張素Ⅱ能有效刺激鈣離子內(nèi)流和膠原合成，但是AngⅡ在DMVD發(fā)病機制中的作用有待進一步研究。

近年來，退行性瓣膜病受到廣泛關注，對介導退變進程的細胞和分子機制的研究已取得一定的進展。但這些研究大部分基于體外細胞和組織模型，仍有許多問題亟需解決，包括明確退行性瓣膜病啟動因子、心臟瓣膜細胞的機械力感受器和傳感機制、明確各種信號機制的復雜的相互作用。DMVD在犬和人表現(xiàn)出驚人的相似，許多證據(jù)表明犬自然發(fā)生的DMVD是一種非常有前景的慢性動物模型。基礎研究得出的新的治療策略已在犬中應用，最終將使人類受益。

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