非小細(xì)胞肺癌相關(guān)IncRNA的研究進(jìn)展

雷鳴，羅迪賢，楊明，周媛

(1 南華大學(xué)附屬常德市第一人民醫(yī)院，湖南常德 415003；2 南華大學(xué)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究所)

長鏈非編碼RNA(IncRNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200個(gè)核苷酸殘基的非編碼RNA,其本身缺乏明顯的開放閱讀框，以RNA的形式在多層面調(diào)控基因的表達(dá)水平。IncRNA起初被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)錄的“垃圾”或“雜音”并未受到重視[1～3]。但后來的研究發(fā)現(xiàn)，IncRNA的異常表達(dá)與腫瘤的形成、浸潤、轉(zhuǎn)移過程相關(guān)，并參與細(xì)胞分化、細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)交換、核內(nèi)運(yùn)輸以及細(xì)胞周期、染色質(zhì)修飾、干細(xì)胞重組、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾等多種重要的調(diào)控過程。最近研究表明[4]，IncRNA對(duì)非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)的侵襲性、轉(zhuǎn)移能力以及增殖能力起重要的調(diào)控作用，并與患者預(yù)后及對(duì)化療藥物的耐藥有密切關(guān)系。本文就近年來國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)的一些IncRNA在NSCLC中的表達(dá)紊亂、生物學(xué)功能及分子機(jī)制作一綜述，旨在為NSCLC的診斷治療、轉(zhuǎn)移及耐藥等方面的研究提供理論依據(jù)。

1 IncRNA概述

IncRNA定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，可通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制調(diào)控基因表達(dá)，參與細(xì)胞的生理過程。IncRNA根據(jù)其蛋白編碼基因的位置關(guān)系分為五類，即正義、反義、雙向、內(nèi)含子和基因間IncRNA[5]。IncRNA在分子遺傳學(xué)和細(xì)胞進(jìn)程中起著重要作用，其主要功能包括：通過抑制RNA聚合酶Ⅱ招募或者誘導(dǎo)染色質(zhì)重構(gòu)來影響下游基因表達(dá)；于蛋白編碼基因上游干擾比鄰的蛋白編碼基因表達(dá)；與蛋白編碼基因轉(zhuǎn)錄本之間形成互補(bǔ)雙鏈，干擾mRNA的剪切；抑制RNA聚合酶的活性，改變蛋白編碼基因的表達(dá)；選擇性剪接序列；調(diào)節(jié)蛋白亞細(xì)胞定位；是小分子 RNA(如siRNA、miRNA)的前體分子；通過與特定蛋白質(zhì)結(jié)合改變蛋白質(zhì)功能及調(diào)節(jié)活性。

2 IncRNA在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機(jī)制

NSCLC的轉(zhuǎn)移是由多個(gè)步驟協(xié)調(diào)進(jìn)行的復(fù)雜過程，腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生期間，NSCLC細(xì)胞從原發(fā)腫瘤區(qū)逃逸而進(jìn)入新器官或者組織，其遷徙和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵性變化取決于上皮到間皮轉(zhuǎn)移(EMT)以及腫瘤細(xì)胞的多能性(CS)。這一過程在胚胎發(fā)育以及腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和遷徙中起著十分重要的作用[6,7]。上皮細(xì)胞的黏附功能的缺失以及獲得間皮細(xì)胞的特征意味著EMT及CS產(chǎn)生。因此，抑制腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵在于抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，而lncRNA可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展[8]。大量數(shù)據(jù)提示，IncRNA可參與多個(gè)水平調(diào)控基因的表達(dá)，影響細(xì)胞的生長和發(fā)育，并且與疾病，尤其是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有著密切關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)，多種IncRNA在NSCLC組織及細(xì)胞系中異常表達(dá)，其通過刺激或抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、遷移、凋亡、及細(xì)胞周期等生物學(xué)過程來調(diào)控NSCLC發(fā)生發(fā)展。探索IncRNA的表達(dá)情況及其作用機(jī)制可能為NSCLC的早期篩查、分子診斷以及臨床治療提供新的思路和靶點(diǎn)。目前研究較為深入的與NSCLC相關(guān)的IncRNA主要有肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1(MALAT1)、H19、母系表達(dá)基因3(MEG3)、HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR)、生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5(GAS5)、FOXF1-AS1、HOXA11-AS。

2.1 MALAT1 MALAT1又稱NEAT2，是最早發(fā)現(xiàn)于肺癌組織的IncRNA，其基因組定位于11q13上，全長超過8 kb。研究證實(shí)，MALAT1在很多腫瘤組織如肺癌、黑素瘤、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌等組織中表達(dá)上調(diào),且與腫瘤的惡化程度密切相關(guān)[9,10]。Schmid等[11]對(duì)352例NSCLC患者的癌組織、癌旁組織進(jìn)行組織芯片分析發(fā)現(xiàn)，MALAT1在其中123例(35%)患者的癌組織中呈高表達(dá)，且癌組織中MALAT1表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、細(xì)胞分化程度、腫瘤的病理分期存在一定的相關(guān)性；MALAT1表達(dá)水平高者病理分期多為晚期，肺癌組織分化程度低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目多，范圍廣，預(yù)后較差。提示MALAT1在NSCLC中表達(dá)具有病程和組織特異性，在有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者腫瘤標(biāo)本中MALAT1的表達(dá)水平顯著上調(diào)，并與患者的TNM分期、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。Gutschner等[12]研究發(fā)現(xiàn)，用siRNA沉默MALAT-1表達(dá)可明顯抑制肺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，與轉(zhuǎn)移相關(guān)基因HMMR的mRNA前體及成熟的mRNA表達(dá)水平均降低，提示MALAT1可調(diào)控轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。進(jìn)一步研究顯示，NSCLC細(xì)胞MALAT被封閉表達(dá)后，可通過轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制調(diào)節(jié)與細(xì)胞侵襲、遷移相關(guān)的基因，影響著mRNA前體的穩(wěn)定性及成熟mRNA的加工過程，導(dǎo)致成熟的mRNA表達(dá)量降低，從而調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞外基質(zhì)和細(xì)胞骨架相關(guān)基因的表達(dá)。NSCLC中MALAT1具有癌基因的特點(diǎn)，能促進(jìn)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，可作為NSCLC轉(zhuǎn)移早期階段和患者預(yù)后的特異性標(biāo)記物。

2.2 H19 H19是一種靠近染色體11p15.5端粒區(qū)，轉(zhuǎn)錄子長度為2.3 kb，由母源性表達(dá)、父源性印跡癌胚基因。研究發(fā)現(xiàn)，H19在胚胎組織形成和發(fā)育過程中呈高表達(dá)，而在出生后的正常組織中沉默?，F(xiàn)有的研究資料表明，lncRNA H19在許多腫瘤組織中異常表達(dá)，如肝癌、宮頸癌、膀胱癌、乳腺癌等，并發(fā)現(xiàn)其具有原癌活性。最新的研究顯示，H19在NSCLC中表達(dá)明顯升高，在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中扮演重要的角色[13]。H19表達(dá)水平與NSCLC腫瘤大小和分期呈正相關(guān)，高水平H19表達(dá)患者預(yù)后較差。進(jìn)一步體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在肺癌中利用基因敲除方法干擾H19表達(dá)后, NSCLC細(xì)胞的集落形成能力和獨(dú)立貼壁能力下降，癌細(xì)胞的分化受到明顯抑制，表明下調(diào)H19可逆轉(zhuǎn)c-Myc對(duì)細(xì)胞的調(diào)控，提示H19可能在c-Myc下游發(fā)揮功能執(zhí)行者的作用。此外，H19還可通過抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá)上調(diào)與miR-675有關(guān)的轉(zhuǎn)錄激活因子Slug，促進(jìn)上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化，從而引起腫瘤細(xì)胞的浸潤和腫瘤的轉(zhuǎn)移。但也有研究發(fā)現(xiàn)[14]，在腎母細(xì)胞瘤、胚胎橫紋肌肉瘤和伯-韋綜合征中，H19作為一種抑癌基因，可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲以及腫瘤新生血管的形成。

2.3 母系表達(dá)基因3(MEG3) MEG3位于染色體14q32.3，長度約為1 700 nt，是第一個(gè)被報(bào)道具有抑癌基因功能的IncRNA。MEG3在多種正常組織中恒定表達(dá)，特別在腦組織呈現(xiàn)高表達(dá)。但在腦癌、鼻咽癌、膀胱癌等多種腫瘤細(xì)胞株中其表達(dá)水平降低甚至出現(xiàn)缺失[15]，提示MEG3異常表達(dá)可抑制體外腫瘤細(xì)胞增殖，MEG3具有腫瘤抑制因子作用。Lu等[16]采用qRT-PCR技術(shù)研究了44例NSCLC患者的癌組織及癌旁組織，發(fā)現(xiàn)MEG3在腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)明顯低于正常組織，與病理分期及腫瘤體積存在相關(guān)性。說明MEG3在NSCLC組織中也可能是一種抑癌基因。目前已有研究發(fā)現(xiàn)，p53是MEG3下游的一個(gè)作用靶點(diǎn)，P53作為轉(zhuǎn)錄因子，能調(diào)控多種腫瘤抑制基因如PTEN、ARF及BRCA1等的表達(dá)，是細(xì)胞內(nèi)的一種非常重要的抑癌基因。一般情況下，細(xì)胞內(nèi)p53蛋白水平非常低，因?yàn)榉核?蛋白酶體途徑可使細(xì)胞內(nèi)p53迅速降解。p53泛素酶是一種E3泛素連接酶，主要是由MDM2介導(dǎo)發(fā)揮其作用，MDM2的抑制作用使p53的穩(wěn)定性增強(qiáng)，因此推測MEG3可通過下調(diào)MDM2的表達(dá)，增加P53蛋白積累，激活各種依賴p53的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，從而起到抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。體外試驗(yàn)進(jìn)一步利用截短體、RNA pulldown和RIP等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證MEG3與p53之間的直接相互作用，影響p53下游靶基因發(fā)揮功能，從而證實(shí)MEG3過度表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)p53介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活作用。

2.4 HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOTAIR) HOTAIR是一個(gè)定位于哺乳動(dòng)物12ql3.13上HOXC位點(diǎn)，長度為2 158 nt的IncRNA，其包括5個(gè)短的外顯子和1個(gè)長外顯子，是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)通過反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控基因表達(dá)的長鏈非編碼RNA。Gupta等[17]研究發(fā)現(xiàn)，HOTAIR可通過與多梳蛋白抑制復(fù)合物2(PRC2)結(jié)合，導(dǎo)致組蛋白H3賴氨酸第27位賴氨酸甲基化，繼而沉默HOXD基因座及相關(guān)抑癌基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。Ge等[18]提出，HOTAIR通過調(diào)控Wnt通路抑制因子(WIF1)來增高胞質(zhì)內(nèi)β-catenin水平，并使之向核內(nèi)聚集，從而促使Snail高水平表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子Snail是EMT轉(zhuǎn)變過程中最重要的調(diào)控因子，可促使上皮標(biāo)志物的特性消失，轉(zhuǎn)而表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞的特性，誘導(dǎo)EMT發(fā)生。由此推測，HOTAIR可能通過調(diào)控Snail水平，參與了腫瘤細(xì)胞EMT過程并最終促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。Nakagawa等[19]研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者癌組織、癌旁正常組織及腦轉(zhuǎn)移組織中HOTAIR表達(dá)水平較正常組織明顯增高，而且其表達(dá)水平與患者的細(xì)胞分化程度、遠(yuǎn)處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或淋巴血管浸潤密切相關(guān)。Ono等[20]通過臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者HOTAIR高水平表達(dá)組比HOTAIR低水平表達(dá)組的患者更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后更差，生存期更短。進(jìn)一步的基因分析顯示，敲除HOTAIR能顯著抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性等，提示對(duì)HOTAIR在肺癌中作用機(jī)制的研究可能為尋找臨床治療中逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥新靶點(diǎn)提供新的思路。

2.5 生長停滯特異性轉(zhuǎn)錄本5(GAS5) GAS5最初是通過抑制削減雜交技術(shù)從鼠NIH3T3細(xì)胞分離出的IncRNA。GAS5是一種潛在孤立的腫瘤抑制基因，與人類T細(xì)胞凋亡有關(guān)。作為小核仁RNA(SnoRNA)5′TOP基因家族中的一員，GAS5定位于非編碼蛋白染色體1q25.1的小開放閱讀框，長度約630 nt，其包含12個(gè)外顯子以及內(nèi)含子區(qū)域的10 box C/D snoRNAs[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，在通過血清饑餓誘導(dǎo)或者翻譯抑制劑處理所致的生長停滯和細(xì)胞凋亡時(shí)，GAS5轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)明顯增加[21]。GAS5在T淋巴細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)GAS5可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和生長停滯，減弱了腫瘤細(xì)胞集落形成的能力[22]。另有研究表明，GAS5在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)，從而推測GAS5在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演了抑癌基因的角色[23]。提示GAS5可調(diào)控NSCLC的發(fā)生與發(fā)展，是一個(gè)潛在的腫瘤標(biāo)志物以及一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。

2.6 FOXF1-AS1 FOXF1-AS1作為一種可能的癌癥抑制因子，又被稱為FENDRR，在胃癌組織中的表達(dá)下降，并與其預(yù)后相關(guān)。而肺癌組織中IncRNA FOXF1-AS1的表達(dá)與正常組織相比也有明顯下調(diào)，且FOXF1-AS1的缺失可以出現(xiàn)在NSCLC的所有類型和階段中。Miao等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC中IncRNA FOXF1-AS1低表達(dá)。在腫瘤細(xì)胞中與腫瘤轉(zhuǎn)移最重要兩個(gè)蛋白是E-鈣黏素和波形蛋白，而在腫瘤細(xì)胞中穩(wěn)定過表達(dá)的IncRNA FOXF1-AS1可下調(diào)這兩種蛋白的表達(dá)，從而調(diào)控EMT，抑制腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。另外，過表達(dá)的IncRNA FOXF1-AS1可抑制腫瘤細(xì)胞莖環(huán)樣結(jié)構(gòu)的形成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的EMT與轉(zhuǎn)移。FOXF1-AS與PRC2蛋白的亞結(jié)構(gòu)EZH2緊密連接，而EZH2在腫瘤細(xì)胞高表達(dá)是腫瘤轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要成分，基因敲除FOXF1-AS1則促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移。在NSCLC中IncRNA FOXF1-AS1表達(dá)下調(diào)與FOXF1蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)，低表達(dá)FOXF1-AS1有利于腫瘤的遷移與EMT。因此通過上調(diào)IncRNA FOXF1-AS1表達(dá)可能為治療NSCLC潛在的藥物靶點(diǎn)

2.7 HOXA11-AS HOXA11-AS與上皮性卵巢癌、膠質(zhì)瘤、胃癌、結(jié)直腸癌以及肺腺癌發(fā)生有關(guān)。有研究表明，IncRNA HOXA11-AS在NSCLC組織以及腫瘤細(xì)胞A549和H1299中高表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞中通過基因敲除IncRNA HOXA11-AS可抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲力，同時(shí)也抑制了腫瘤細(xì)胞的EMT過程[25]。敲除IncRNA HOXA11-AS后，與EMT過程進(jìn)展有關(guān)的蛋白ZEB1、ZEB2、Snail1、Snai2、N-cadherin在腫瘤細(xì)胞A549和H1299中低表達(dá)，而E-cadherin表達(dá)上調(diào)。IncRNA HOXA11-AS在腫瘤細(xì)胞A549和H1299細(xì)胞核和部分細(xì)胞質(zhì)區(qū)域高表達(dá)。miR-200b靶向下調(diào)EZH2基因，抑制腫瘤細(xì)胞的EMT過程，另外EZH2和DNMT基因可結(jié)合miR-200b基因啟動(dòng)子區(qū)域，IncRNA HOXA11-AS可與EZH2和DNMT基因相互作用抑制miR-200b表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的EMT發(fā)生。因此下調(diào)IncRNA HOXA11-AS表達(dá)可能為治療NSCLC的一個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)。

2.8 AGAP2-AS1 AGAP2-AS1是由位于12q14.1位置的長度約1 567個(gè)核苷酸的基因轉(zhuǎn)錄而來。研究發(fā)現(xiàn)，AGAP2-AS1在胃癌組織及細(xì)胞株中高表達(dá)，且AGAP2-AS1高表達(dá)的NSCLC患者的預(yù)后較差。有研究表明，體外實(shí)驗(yàn)中敲除AGAP2-AS1能抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，遷徙和侵襲，同時(shí)提高腫瘤細(xì)胞的凋亡率[26]，且AGAP2-AS1在NSCLC患者腫瘤組織高表達(dá)，AGAP2-AS1通過下調(diào)基因LATS2表達(dá)從而抑制NSCLC細(xì)胞的增殖。Fan等[27]研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC患者中AGAP2-19與腫瘤的分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，這意味著AGAP2-19功能可能是一種腫瘤啟動(dòng)因子。臨床生存分析AGAP2-AS1高表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后較差有關(guān)。因此，AGAP2-AS1表達(dá)檢測有助于NSCLC的診斷及預(yù)后判斷。

3 總結(jié)與展望

IncRNA是一組非編碼蛋白質(zhì)的RNA，具有多種生物學(xué)活性。多方面數(shù)據(jù)已經(jīng)證實(shí)，IncRNA可以影響細(xì)胞凋亡、信號(hào)通路和腫瘤轉(zhuǎn)移及浸潤等過程，其水平的表達(dá)異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。隨著新一代高通量測序技術(shù)，生物芯片技術(shù)的成熟以及對(duì)于腫瘤的研究進(jìn)一步滲透，IncRNA的功能及作用機(jī)制越來越顯得清晰。IncRNA可用作非侵襲性篩查，現(xiàn)已有多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，IncRNA與NSCLC發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，可能成為NSCLC早期診斷的分子診斷標(biāo)志物，并成為治療NSCLC的藥物作用以及監(jiān)測預(yù)后的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。然而由于IncRNA本身作用方式的多樣性及不確定性，其對(duì)NSCLC具體的調(diào)控分子機(jī)制仍停留在未知階段，有待進(jìn)一步探索。目前研究面臨的困難仍較多，如研究的手段較少、缺少高質(zhì)量的數(shù)據(jù)庫等。另外，一些重要的InRNA在體內(nèi)表達(dá)水平較低，也增大了研究的難度。

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