miRNA在疾病診斷和治療中的研究進展*

于水瀾，宋 琳，張淑香

1.黑龍江中醫(yī)藥大學 基礎醫(yī)學院(哈爾濱150040)

1 miRNA的來源

miRNA是一組小的非編碼RNA(ncRNA)分子，通過調節(jié)靶mRNA轉錄或轉錄后翻譯，誘導靶基因表達沉默而發(fā)揮廣泛生物學作用[1]。1993年，科學研究人員通過正向遺傳學發(fā)現(xiàn)第一個來自秀麗線蟲中的miRNA，鑒定了發(fā)育調控因子lin-4[2-3]。第二個線蟲miRNA let-7直到7年后才被識別[2]。Ruvkun和Ambros實驗室認為，miRNA是一種常規(guī)的蛋白質編碼基因。他們做了令人吃驚的發(fā)現(xiàn)，即lin-4不編碼蛋白質，而是編碼22個核苷酸的調控RNA[4-5]。他們證明lin-4 RNA可與線蟲發(fā)育網(wǎng)中的另一個基因lin-14的mRNA進行堿基配對，并控制lin-14蛋白的產(chǎn)生[5]。然而，迄今為止，人類發(fā)現(xiàn)了1 900多個miRNA[3]，其中許多已與人類常見疾病有關。通過高通量基因組學、生物信息學與傳統(tǒng)分子生物學技術和動物模型相結合，miRNA的相關研究從實驗室向臨床轉變，為人類健康帶來極大的益處。國內外研究文獻多是miRNA對于某一種或某一類疾病的研究或綜合闡述，而在miRNA對于多種疾病的闡述方面相對較少。因此，本文主要選擇了近年來死亡率較高的幾種疾病，從其診斷和治療的角度對miRNA的相關研究進展進行綜述。

2 miRNA在疾病診斷和治療中的研究進展

2.1 癌癥

2.1.1 肝癌 Tao等[6]以c-Myc和AKT / Ras誘導的肝腫瘤為模型，確定了選定的miRNA在體內的腫瘤抑制活性。該研究團隊使用qRT-PCR證明了8個miRNA的表達：miR-101、miR-107、miR-122、miR-29、miR-365、miR-375、miR-378和miR-802，且在c-Myc和AKT / Ras肝腫瘤模型中下調，其中4個miRNA(miR-101、miR-29、miR-107和miR-122)的表達與患者相關性顯著，而在非腫瘤肝組織中則不表達。Cartier等[7]利用功能篩選系統(tǒng)，確定了10種新miRNA，其在惡性肝細胞中控制磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)表達，其中miR-4510、miR-203a-3p、miR-548aa、miR-376b-3p和miR-548v降低GPC3的表達水平。與非腫瘤性肝臟相比，這5種miRNA在腫瘤中顯著下調，并抑制腫瘤細胞增殖。其中，miR-4510上調了幾個腫瘤抑制基因的表達，同時降低了其他促癌基因的表達，為miR-4510的腫瘤抑制活性提供了強大的分子、細胞和體內證據(jù)，從而使這種miRNA在肝細胞癌治療中的潛在價值受到關注。

2.1.2 肺癌 Cazzoli等[8]通過獨立的較大樣本組評估選定的miRNA。選擇4種miRNA(miR-378a、miR-379、miR-139-5p和miR-200b-5p)進行篩選測試，將人群分為兩組：結節(jié)(肺腺癌+癌)和非結節(jié)(健康的前吸煙者)。在“結節(jié)”組中選擇6種miRNA(miR-151a-5p、miR-30a-3p、miR-200b-5p、miR-629、miR-100和miR-154-3p)進行第2次測試以區(qū)分肺腺癌和肉芽腫。實驗結果顯示，“篩查試驗”顯示敏感性為97.5%，特異性為72.0%，AUC ROC為90.8%；“診斷試驗”敏感性為96.0%，特異性為60.0%，AUC ROC為76.0%。這一研究證明了miRNA作為肺癌篩查試驗和診斷試驗生物標志物的潛能。Takamizawa[10]及其同事提供了首次證實miRNA表達異常與肺癌預后相關的證據(jù)。與正常肺組織中的表達水平相比，許多患者肺癌細胞系中l(wèi)et-7的表達顯著降低，且let-7低表達的患者總體生存率低于let-7高表達患者。除let-7外，還有一些其他的miRNA被認為對肺癌的預后有意義。Yanaihara等[9]分析了104對肺癌和相應的非癌性肺組織中的miRNA表達，并鑒定出表達程度在統(tǒng)計學上顯著差異的miRNA。肺腺癌中的miRNA表達模式與鱗狀細胞癌相比有顯著差異。肺腺癌患者高表達hsa-mir-155或降低hsa-let-7a-2表達與預后不良相關。然而在多變量分析中，只有高hsa-mir-155表達仍具有預后意義，以上研究均可說明miRNA有助于肺癌的診斷和預后。

2.1.3 膀胱癌 miRNA標記的評估提供了區(qū)分肌肉浸潤性膀胱癌，非肌層浸潤性膀胱癌和非癌性對照的方法，使用微陣列技術研究了20例膀胱癌組和18例對照組。由于參與人數(shù)較少，該研究僅能提供了初步的數(shù)據(jù)，表明這種方法對于早期發(fā)現(xiàn)膀胱癌的實用性[10-11]。Ratert等[12]利用微陣列技術，然后使用定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)的驗證步驟進行篩選研究，檢測了15個特定的miRNA，其中7個(miR-125b、miR-130a、miR-139-5p、miR-145、miR-199a-3p、miR-214和miR-222)上調，相對于健康組織，8個miRNA在腫瘤組織中下調。此外，發(fā)現(xiàn)miR-20a、miR-106b、miR-141和miR-205在膀胱癌中上調[13]，與其他位置如腎或前列腺癌中的表達行為相反[14]。

2.2 心血管疾病

2.2.1 心肌梗死(MI) Liu等[15]使用微陣列比較了在MI模型大鼠中使用或不使用骨骼肌(SkM)細胞療法的miRNA和mRNA的表達譜，探討SkM對缺血大鼠的心臟保護作用，并通過定量實時PCR法證實了miRNA表達與潛在靶基因mRNA水平的一致性。數(shù)據(jù)顯示，與未處理的MI后相比，MI組中有160種miRNA差異性表達，在SkM組中有78種miRNA差異性表達。Liu等[15]重點研究了5種凋亡相關的miRNA(miR-30a-5p、miR-30c-5p、miR-145-5p、miR-143-3p和miR-140-3p)和7種抗凋亡靶基因。同時，也為進一步研究SkM移植背景下差異表達的miRNA的功能特性和針對MI的miRNA干細胞療法的開發(fā)提供了極好的起點，并且證明靶基因可能成為心臟恢復后的新的治療靶標MI。Cheng等[16]評估了miRNA與心肌梗塞之間關聯(lián)性，且使用測試靈敏度和特異性的估計來評估診斷性能。結果顯示，總miRNA：敏感性為0.78，特異性為0.82；miR-499：靈敏度為0.88，特異性為0.87；miR-1：靈敏度為0.63，特異性為0.76；miR-133a：靈敏度為0.89，特異性為0.87；miR-208b：靈敏度為0.78，特異性為0.88。miRNA與其他心肌梗死診斷標志物之間的相關性明顯。說明miRNA，特別是miR-499和miR-133a可能適合用作心肌梗死的診斷標志物。

2.2.2 動脈粥樣硬化 Hartmann等[17]調查內皮Dicer單核細胞黏附和動脈粥樣硬化的作用。MiR-103在Dicer缺陷的EC中下調，并通過靶向KLF4促進CXCL1介導的單核細胞黏附?？偟膩碚f，Dicer可通過增加miR-103表達來增強動脈粥樣硬化和內皮炎癥。Dicer缺乏ApoE小鼠內皮細胞通過下調CXCL1減少單核細胞與早期動脈粥樣硬化內皮的黏附，從而減少病變的形成。因此，動脈粥樣硬化的動脈位點上的酶活性可能通過產(chǎn)生促炎性的miRNA而發(fā)揮致動脈粥樣硬化的作用，這也使得miRNA成為潛在的動脈粥樣硬化診斷標志物。

2.2.3 冠心病(CHD) Huan等[18]研究了186例CHD病例和186例對照的全血miRNA和mRNA表達與遺傳變異進行整合，系統(tǒng)地描述了冠心病的復雜基因組結構。在FDR< 0.2時，15種miRNA在CHD病例和對照之間差異表達。發(fā)現(xiàn)CHD病例和對照組之間miRNA-mRNA相關性存在很大差異。此外，3種miRNA(miR-1275、miR-365a-3p和miR-150-5p)與CHD因果關聯(lián)的mRNA共表達模塊相關，且反映了B細胞中心免疫功能的失調。研究結果證實，miRNA是通過遺傳控制和與mRNA緊密共表達而參與CHD的生物過程的重要調節(jié)劑，有利于CHD的診斷和治療。

2.2.4 高血壓 一些研究已強調了miRNA參與血壓調節(jié)，特別是影響腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)。Marques等[19]比較了未經(jīng)治療的高血壓和血壓正常的個體腎組織中miRNA和mRNA的表達。使用微陣列技術，篩選了850個miRNA，并鑒定了9個表達差異的miRNA，其中兩個miRNA(miR-181a和miR-663)與人腎中抑制腎素表達相關。此外，miR-132和miR-212在接受10 d的血管緊張素-Ⅱ注射大鼠的心臟，二者在主動脈和腎臟中上調，并且下調1型血管緊張素-Ⅱ受體阻滯劑治療患者的動脈，提示miR-132和miR-212在血管緊張素Ⅱ介導的高血壓中的作用。有研究[20]還發(fā)現(xiàn)，miR-145在高血壓患者和血壓正常的頸動脈內膜切除術患者的動脈粥樣硬化斑塊中過度表達，暗示miR-145是血壓介導的血管損傷的潛在關鍵調節(jié)因子。

2.3 其他疾病

2.3.1 肝炎 Winther等[21]通過隨訪一組42例CHB患兒，抽出180個血液樣本，先前鑒定的16種miRNA的血漿水平通過定量實時聚合酶鏈式反應進行分析，使用ARCHITECT HbsAg測定法定量血漿HBsAg。結果發(fā)現(xiàn)，CHB患兒中存在14 ～ 16個血漿miRNA，且在疾病的不同免疫階段顯著差異表達，只有miR-122被證明可抑制HBV的復制。然而，需要進一步的研究來提高對microRNA和RNA的理解，以及HBsAg在兒童慢性乙型肝炎發(fā)病中的作用。Motawi1等[22]調查了7種選擇的干擾素相關微RNA(miR-146a、miR-34a、miR-130a、miR-19a、miR-192、miR-195和miR-296)，選擇106名CHC患者和40名匹配的健康對照。與對照相比，血清miR-34a、miR-130a、miR-19a、miR-192、miR-195和miR-296上調，而血清miR-146a下調。其中，miR-34a、miR-195和miR-192可預測治療反應。分析結果可用作CHC治療個體化的新型非侵入性診斷和預后藥物遺傳學生物標志物，并可幫助鑒定基于miRNA的新的抗病毒藥物。

2.3.2 免疫性疾病 據(jù)報道，miR-21，mi-148a，mi-126和mi-29b[23-24]等幾種miRNA的過度表達通過靶向DNMT1影響狼瘡CD4+T細胞的DNA甲基化機制。miR-21通過靶向Ras脒基核苷酸釋放蛋白1(RASGRP1)基因間接改變DNMT1的表達，該基因中和DNMT1上游的Ras-MAPK通路。然而，miR-148a和miR-126通過與3'-UTR的相互作用直接抑制DNMT1的翻譯。狼瘡CD4+T細胞中miR-29b[24]和miR-126的異常過度表達導致甲基化敏感基因CD11a和CD70的低甲基化和過度表達，導致T細胞和B細胞活動過度。狼瘡患者CD4+T細胞中這種miRNA表達的抑制引起逆轉作用。因此，miRNA特有的行為可能被用作炎癥性疾病侵襲性表型的預后生物標志物。

2.3.3 酒精性肝病和非酒精性肝病 酒精濫用會損害肝臟器官，但miRNA失調被認為在酒精性肝病中起關鍵作用。酒精性肝病(ALD)小鼠模型中miR-320、miR-486、miR-705和miR-1224的組織表達增加，且miR-27b、miR-214、miR-199a-3p、miR-182、miR-183、miR-200a和miR-322的表達水平降低[25]。大鼠模型顯示，飲酒后外泌體中miR-122和miR-155的血清水平升高[26]。然而，由于酒精的全身作用，循環(huán)的miRNA生物標志物可能并非完全來源于肝臟[27]。Chen等[28]發(fā)現(xiàn)大鼠32個血清miRNAs上調或下調，但肝臟和血清之間的表達水平僅與miR-185、miR-199a-3p、miR-214和miR-490相關。在非酒精性脂肪肝病(NAFLD)肥胖小鼠模型中，miR-122、miR-34a、miR-31、miR-103、miR-107、miR-194、miR-334-5p、miR-221和miR-200a上調，miR-29c、miR-451和miR-21在ob / ob小鼠中下調[25]。miR-146，miR-152和miR-200在高脂飲食大鼠中上調[29]。

3 展望

癌癥和心血管疾病是世界范圍內發(fā)病率和病死率較高的疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，估計每年有1 750萬人死于心血管疾病，絕大多數(shù)死于中風和冠狀動脈疾病(CAD)，占全球死亡人數(shù)的31%[30]；2012年約有1 400萬癌癥新病例和820萬癌癥死亡人數(shù)，這一數(shù)字在未來20年預計將上升約70%[31]，這嚴重影響了患者的生活質量。因此，建立一種可以診斷或治療癌癥、心血管及其他疾病的檢測指標是非常必要的，而miRNA近來已成為調節(jié)基因表達的中心參與者之一，許多科學研究已揭示了miRNA在常見人類疾病中的作用，miRNA生物標志物和miRNA藥物的同時發(fā)展已經(jīng)在改善公眾健康方面邁出了一大步。

生物標志物鑒定的最終目標是開發(fā)更好的臨床檢測方法，改善疾病的診斷或預后。實際上，miRNA已經(jīng)被認為是下一代生物標志物的首選候選者，因為它們比其他候選物如蛋白質和代謝物具有一些優(yōu)勢。首先，miRNA生物標志物由于它們在調節(jié)級聯(lián)中的上游位置而更可能導致早期診斷。其次，通過基因組工具如寡核苷酸微陣列和深度測序更容易發(fā)現(xiàn)新的miRNA生物標志物，其比蛋白質和代謝物生物標志物鑒定的主要工具——質譜法提供更高的通量。再次，擴增低豐度miRNA生物標志物，然后通過實時定量PCR(qPCR)在臨床設置中檢測。qPCR已經(jīng)在FDA批準的臨床試驗中使用;而檢測低豐度蛋白質或代謝物則沒有等效的方法[3]。

綜上所述，在廣泛的人類疾病中已經(jīng)鑒定出miRNA的異常表達譜，顯示了miRNA作為具有高度特異性和敏感性的癌癥新型診斷和預后生物標志物的巨大潛力。今后癌癥和心血管疾病的治療有望得到改善。