干細(xì)胞分型及其治療缺血性心肌病機(jī)制的研究進(jìn)展

王紅陽，劉家袁, 梁貴友，余麗梅

(1遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,貴州遵義563000；2貴州省組織損傷修復(fù)與再生醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心)

缺血性心肌病是指由于長(zhǎng)期心肌缺血導(dǎo)致心肌局限性或彌漫性纖維化，從而產(chǎn)生心臟收縮和舒張功能受損，引起心臟擴(kuò)大或僵硬、充血性心力衰竭、心律失常等一系列臨床表現(xiàn)的臨床綜合征。目前，臨床中多采用藥物、介入手術(shù)及冠脈旁路移植術(shù)等方式對(duì)患者進(jìn)行治療，減緩疾病的進(jìn)展，一定程度改善心臟功能，然而由于心肌細(xì)胞的缺血壞死，預(yù)后多不理想。近年來，隨著對(duì)干細(xì)胞臨床研究的深入及干細(xì)胞技術(shù)的逐漸成熟，人們發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植可通過促進(jìn)血管新生、心肌再生及旁分泌等作用改善心功能，有望成為治療缺血性心臟病的新舉措，心臟干細(xì)胞(CSCs)的再生修復(fù)等也逐漸成為新的治療靶點(diǎn)。由于其種類較多，因此不同的干細(xì)胞治療缺血性心肌病的作用機(jī)制也不盡相同。本文就干細(xì)胞分型及其治療缺血性心肌病的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 干細(xì)胞的類型

干細(xì)胞具有自我更新和多向分化潛能，具有多種功能活性，一定條件下，可以在體內(nèi)外誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞等多種功能細(xì)胞。根據(jù)干細(xì)胞所處的發(fā)育階段可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。根據(jù)干細(xì)胞的發(fā)育潛能可分為全能干細(xì)胞、亞全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞及單能干細(xì)胞，因其具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，被稱為“萬用細(xì)胞”。移植的干細(xì)胞主要包括兩大類：成體干細(xì)胞和多功能干細(xì)胞，主要包括骨骼肌成肌細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ESCs)、骨髓來源干細(xì)胞(BMSCs)、羊膜干細(xì)胞及CSCs等。

1.1 骨骼肌成肌細(xì)胞 骨骼肌成肌細(xì)胞是一類位于細(xì)胞膜和肌膜之間可以分化為骨骼肌細(xì)胞的起源細(xì)胞，可在創(chuàng)傷后增生、重構(gòu)肌肉組織。是目前臨床實(shí)驗(yàn)和研究中移植應(yīng)用最多的細(xì)胞之一，具有耐受缺血、缺氧環(huán)境；定向分化成具有橫紋肌特性的肌細(xì)胞；易提取、分離、培養(yǎng)和增殖等特點(diǎn)。移植后，骨骼肌成肌細(xì)胞雖不能轉(zhuǎn)分化成心肌細(xì)胞，但能與心肌細(xì)胞以合胞體的狀態(tài)結(jié)合，提高心肌的收縮力[1]。然而，Abreham等[2]研究指出移植入梗死區(qū)的骨骼肌成肌細(xì)胞只能分化成保留骨骼肌特征的心肌細(xì)胞，不能與周圍的心肌細(xì)胞形成電生理偶聯(lián)，可引起心律失常的發(fā)生。采用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)將Wnt基因轉(zhuǎn)入骨骼肌成肌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中心肌早期標(biāo)志物相關(guān)基因NKx2.5和連接蛋白43(Cx43)以及晚期心肌標(biāo)志物相關(guān)基因α、β肌球蛋白重鏈和腦鈉尿肽mRNA表達(dá)水平升高[3]，表明轉(zhuǎn)入的Wnt基因可以促進(jìn)骨骼肌成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為心肌細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因的骨骼肌成肌細(xì)胞可能為缺血性心肌病治療的研究提供了新方向。

1.2 ESCs ESCs是從早期胚胎或原始性腺中分離出來的一類細(xì)胞，它具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性。體內(nèi)外環(huán)境中，ESCs能被誘導(dǎo)分化為機(jī)體所有的細(xì)胞類型。已有多項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明由ESCs分化的心肌細(xì)胞具有早期心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，在移植入心肌梗死區(qū)域后能夠與宿主心肌細(xì)胞發(fā)生偶聯(lián)，從而一定程度地改善心臟功能[4]。然而，由于移植的ESCs可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，且作為異體細(xì)胞，移植后也可能產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)；導(dǎo)致的心律失常和胚胎獲取也頗受倫理爭(zhēng)議，因此，嚴(yán)重影響ESCs的臨床應(yīng)用。

1.3 BMSCs BMSCs是一類存在于骨髓內(nèi)具有自我復(fù)制和多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在一定的誘導(dǎo)條件下，能向成骨、脂肪和成軟骨等細(xì)胞方向分化，利用其貼壁生長(zhǎng)、采集容易、無免疫排斥、可自體移植、無倫理爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn)，已成為臨床研究的主要干細(xì)胞。已有研究表明，向缺血性心肌病患者的受損心肌區(qū)域移植入BMSCs能夠促進(jìn)新血管生成，減輕心肌纖維化，從而改善心功能。也有報(bào)道指出粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)能夠刺激BMSCs釋放進(jìn)入外周血。Kuhlmann等[5]研究發(fā)現(xiàn)，與單用BMSCs相比，實(shí)驗(yàn)組利用G-CSF刺激BMSCs治療急性心肌梗死可以減少室性心律失常的發(fā)生，心肌梗死區(qū)域心肌上的Cx43也明顯增高，達(dá)到維持在能夠穩(wěn)定心肌細(xì)胞正常傳導(dǎo)速度的水平。也有研究發(fā)現(xiàn)，G-CSF刺激動(dòng)員BMSCs還有促進(jìn)心肌血管再生和減緩心肌缺血再灌注損傷的作用。BMSCs注射進(jìn)缺血性心肌病患者體內(nèi)，患者的NYHA心功能分級(jí)、生活質(zhì)量和存活率顯著增高，且缺血性心肌病患者(LVEF<50%)在經(jīng)心內(nèi)膜向心肌內(nèi)注射BMSCs 30 d后，其心肌的梗死面積顯著減少，心功能狀態(tài)顯著改善，證明移植BMSCs治療缺血性心肌病和心功能不全不但安全，而且有效[6，7]。然而，BMSCs的作用機(jī)制目前尚未完全闡明。盡管BMSCs能否分化為心肌細(xì)胞還存在不同證據(jù)，但通過旁分泌作用，促進(jìn)心肌血管生成和心肌細(xì)胞再生的作用機(jī)制日益清晰。

造血干細(xì)胞(HSCs)是來源于骨髓中具有自我更新和造血多譜系細(xì)胞分化潛能的干細(xì)胞，一般來源于骨髓、外周血和臍帶血。人的HSCs主要表達(dá)CD33、CD34、C-Kit和CD133標(biāo)志分子。由于HSCs是各種血細(xì)胞的前體細(xì)胞，臨床采用HSCs移植治療人類惡性血液病已是較為成熟的技術(shù)，也是治愈白血病等重要手段。已有研究發(fā)現(xiàn)，將小鼠HSCs與原代心肌細(xì)胞一起培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)其能表達(dá)心肌細(xì)胞膜上的內(nèi)向整流鉀離子通道；從動(dòng)物骨髓中分離出來的HSCs可以促進(jìn)心肌血管再生和改善心功能[8]。近年的研究證明，HSCs是通過旁分泌途徑改善急性心肌梗死后的心功能和抑制心室重建的作用，促進(jìn)心肌血管再生、抑制心肌細(xì)胞凋亡、聚集心臟祖細(xì)胞和改變心肌細(xì)胞外基質(zhì)成分等。

內(nèi)皮祖細(xì)胞 (EPCs)是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在生理或病理因素的刺激下，可從骨髓動(dòng)員到外周血中參與損傷血管的修復(fù)。主要存在于骨髓、外周血、胎兒肝臟和臍帶血中，臨床研究及應(yīng)用中多采用骨髓和臍帶血來源的EPCs。早在1997年日本學(xué)者Asahara就從外周血中分離出EPCs，證實(shí)了其可以在缺血組織和缺血器官中促進(jìn)血管的生長(zhǎng)。在創(chuàng)傷、局部組織缺血、血管損傷等條件刺激下，EPCs將會(huì)從骨髓和局部組織中動(dòng)員，而產(chǎn)生新的血管。目前認(rèn)為EPCs可能通過分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞和調(diào)控血管生長(zhǎng)因子，從而促進(jìn)心肌新血管再生修復(fù)受損心肌。已有研究發(fā)現(xiàn)通過向頑固性心絞痛患者心肌內(nèi)注射EPCs治療，顯示患者的左心室功能、臨床癥狀得到了明顯改善，進(jìn)而證明利用EPCs治療頑固性心絞痛是安全有效的[9]。

1.4 羊膜干細(xì)胞 羊膜干細(xì)胞來源于產(chǎn)婦分娩后廢棄的胎盤附屬物，羊膜來源的干細(xì)胞主要包括人羊膜上皮細(xì)胞和人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞，具有來源廣泛、獲取方便、無創(chuàng)采集、細(xì)胞量豐富及無論理爭(zhēng)議等優(yōu)點(diǎn)。人羊膜干細(xì)胞靜脈或原位移植后，表現(xiàn)出低免疫原性，無明顯排異反應(yīng)和致瘤性，具有顯著的抗炎作用，還可產(chǎn)生多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子，通過旁分泌作用促進(jìn)損傷或壞死細(xì)胞的再生，在心肌組織的缺血損傷中具有良好的應(yīng)用前景。結(jié)扎大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支建立心肌梗死模型，1周后經(jīng)心外膜移植2×106個(gè)BrdU標(biāo)記的人羊膜上皮干細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人羊膜上皮干細(xì)胞移植入心臟，明顯改善急性心肌梗死大鼠心臟功能，減緩心室重構(gòu)，促進(jìn)心肌細(xì)胞再生及新生血管形成，減輕心肌缺血的作用[10]。

1.5 CSCs 傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，成年哺乳動(dòng)物的心肌細(xì)胞是永久性細(xì)胞，已不具有完全修復(fù)損傷再生的作用。然而，近年的研究發(fā)現(xiàn)剛出生的胎兒和成熟心臟都具有一定的再生修復(fù)能力，心臟中的CSCs可分化為心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞，從而修復(fù)受損的心肌組織，減少心肌梗死面積。根據(jù)CSCs表面標(biāo)志物結(jié)合生物學(xué)特性將其分為六類：c-kit+、Sca-1+、SP、Isl-1+、SSEA-1+及心肌球衍生細(xì)胞(CDCs)。目前c-kit+細(xì)胞是臨床研究最廣泛及最具多能干細(xì)胞特征的一類細(xì)胞，具有克隆生長(zhǎng)、自我更新及多向分化潛能等優(yōu)點(diǎn)。Ellison等[11]通過觀察敲除心衰小鼠CSCs后的心功能狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)小鼠的心臟將會(huì)終止再生及修復(fù)功能，當(dāng)重新向心肌內(nèi)注射入c-kit+CSCs后，小鼠心臟的受損部位將會(huì)得到修復(fù)，表明c-kit+CSCs在受損心臟的修復(fù)過程中起著重要的作用。利用CSCs治療缺血性心肌病的Ⅰ期臨床試驗(yàn)研究中，將心肌梗死后LVEF<40%的患者隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組經(jīng)冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射自體CSCs，4個(gè)月后心臟磁共振成像檢測(cè)顯示，實(shí)驗(yàn)組心肌的梗死面積顯著減少，MLHFQ評(píng)分明顯增高[12]。經(jīng)冠脈內(nèi)注射CDCs后能夠治療患者的缺血性心肌病癥狀，實(shí)驗(yàn)將心肌梗死后2～4周的心衰患者(25%≤LVEF≤45%)隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組將自體CDCs輸入心肌梗死區(qū)域， 6個(gè)月和12個(gè)月后，與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組的心肌梗死面積顯著減少，心肌存活率和收縮力都顯著增強(qiáng)，且無不良反應(yīng)發(fā)生。由此說明，采用經(jīng)冠脈內(nèi)注射CDCs進(jìn)行治療缺血性心肌病的方法安全有效[13]。此外，近幾年的研究表明干細(xì)胞來源的外泌體在干細(xì)胞發(fā)揮旁分泌作用[14]，外泌體可以通過抑制心肌細(xì)胞凋亡來減少心肌梗死面積；也可作用于內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和轉(zhuǎn)移；作用于中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞，減緩心肌的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷，刺激CDCs分化為心肌細(xì)胞，從而改善缺血性心肌病患者的心功能。

2 干細(xì)胞治療缺血性心臟病的作用機(jī)制

2.1 直接分化為功能細(xì)胞 研究發(fā)現(xiàn)，因干細(xì)胞具有多向分化潛能，在一定的誘導(dǎo)條件下可以分化為心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞。在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究中，均可以誘導(dǎo)BMSCs向心肌細(xì)胞分化，將BMSCs移植入心肌梗死區(qū)域后，它能表達(dá)心肌細(xì)胞表面標(biāo)志物如肌鈣蛋白T、α-肌動(dòng)蛋白和連接蛋白等，也可表達(dá)平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性蛋白[15]，說明移植后的BMSCs分化為心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞后，既可減少心肌梗死面積，也可促進(jìn)心肌再生和血管再生，從而顯著改善缺血心肌的心臟功能。

2.2 促進(jìn)血管再生 諸多研究表明，干細(xì)胞用于缺血性心肌病的治療，能夠促進(jìn)心肌血管的生成，改善心肌的血供，減少心肌細(xì)胞的壞死，進(jìn)而改善心功能。BMSCs能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂、增生和遷移，從而實(shí)現(xiàn)心肌局部缺血組織的血管再生，進(jìn)而改善心臟的功能。ESCs在缺氧條件下也能夠分泌外泌體，從而促進(jìn)胚胎中的微血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移及血管化。向心肌梗死小鼠的心肌內(nèi)注射BMSCs來源的微泡能夠顯著改善梗死心肌的血流狀況，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增生和遷移，促進(jìn)心肌內(nèi)微血管增生，抑制梗死區(qū)域心肌細(xì)胞凋亡，從而顯著改善心肌的功能[16]，外周血、脾臟、脂肪等其他來源的干細(xì)胞研究中，也發(fā)現(xiàn)在促進(jìn)血管再生過程中存在著相似的機(jī)制和效果。

2.3 旁分泌作用 干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用日益受到重視，外泌體作為干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)的代表性物質(zhì)，已被作為一種新型替代療法應(yīng)用于治療心血管疾病中。不同干細(xì)胞來源的外泌體可通過促進(jìn)受體細(xì)胞存活、增殖、新生血管形成、改善心肌內(nèi)側(cè)支循環(huán)、改善心肌代謝、抑制心肌細(xì)胞凋亡、抑制心肌纖維化、改善心肌重構(gòu)等多種方式，促進(jìn)梗死心肌再生修復(fù)，提高心臟功能。在心肌的再灌注治療中，可以明顯減輕心肌的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激損傷，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡，減少心肌的梗死面積。MSCs還可通過產(chǎn)生一些造血細(xì)胞因子來發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、干細(xì)胞因子等。

2.4 免疫調(diào)節(jié)作用 間充質(zhì)干細(xì)胞具有低免疫原性及免疫調(diào)節(jié)的作用，能夠逃避免疫識(shí)別和抑制免疫應(yīng)答,還能夠通過對(duì)抗原提呈細(xì)胞、T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞的影響而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs誘導(dǎo)的免疫抑制反應(yīng)不是直接的細(xì)胞效應(yīng)，而是由調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞釋放到炎癥微環(huán)境中的多種炎性細(xì)胞因子和抗炎因子介導(dǎo)，如INF-γ、TNF-α及IL-1α和β、IL-4、IL-10等。缺血性心肌病患者移植BMSCs后，心肌梗死面積顯著減少，心臟功能不但有所改善，心肌組織中的炎癥因子TNF-α、IL-1β等也顯著減少。

盡管多個(gè)國(guó)家在積極開展干細(xì)胞治療缺血性心肌病的臨床研究與轉(zhuǎn)化應(yīng)用，目前也尚未觀察到間充質(zhì)干細(xì)胞移植后引起的嚴(yán)重不良反應(yīng)，但仍缺乏大規(guī)模臨床研究，其遠(yuǎn)期療效與安全性尚無法預(yù)知。隨著干細(xì)胞活體示蹤、心肌存活與功能檢測(cè)及評(píng)估新技術(shù)的誕生，干細(xì)胞移植治療心肌梗死及心功能不全等疾病的臨床應(yīng)用也將會(huì)得到更大發(fā)展。選擇適宜的干細(xì)胞類型，探索其在臨床應(yīng)用中的有效性和安全性，有望提高缺血性心肌病的治療效果。

[1] Zhu K, Guo C, Xia Y, et al. Transplantation of novel vascular endothelial growth factor gene delivery system manipulated skeletal myoblasts promote myocardial repair[J]. Int J Cardiol, 2013,168(3): 2622-2631.

[2] Abraham MR, Henrikson CA, Tung L, et al. Antiarrhythmic engineering of skeletal myoblasts for cardiac transplantation[J]. Circ Res, 2005,97(2):159-167.

[3] Xiang G, Yang Q, Wang B, et al. Lentivirus-mediated Wnt11 gene transfer enhances Cardiomyogenic differentiation of skeletal muscle-derived stem cells[J]. MolTher, 2011,19(4):790-796.

[4] Engels MC, Rajarajan K, Feistritzer R, et al. Insulin-like growth factor promotes cardiac lineage induction in vitro by selective expansion of early mesoderm[J]. Stem Cells, 2014,32(6):1493-1502.

[5] Kuhlmann MT, Kirchhof P, Klocke R, et al. G-CSF/SCF reduces inducible arrhythmias in the infarcted heart potentially via increased connexin43 expression and arteriogenesis[J]. J Exp Med, 2006,203(1):87-97.

[6] Bartunek J, Terzic A, Davison BA, et al. Cardiopoietic cell therapy for advanced ischaemic heart failure: results at 39 weeks of the prospective, randomized, double blind, sham-controlled CHART-1 clinical trial[J]. Eur Heart J, 2017,38(9):648-660.

[7] Heldman AW, DiFede DL, Fishman JE, et al. Transendocardial mesenchymal stem cells and mononuclear bone marrow cells for ischemic cardiomyopathy: the TAC-HFT randomized trial[J]. JAMA, 2014,311 (1):62-73.

[8] Lezaic L, Socan A, Peitl PK, et al. Imaging and 1-day kinetics of intracoronary stem cell transplantation in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy[J]. Nucl Med Biol, 2016,43(7):410-414.

[9] Banovic M, Obradovic S, Beleslin B. The stem-cell application in ischemic heart disease: basic principles, specifics and practical experience from clinical studies[J]. Srp Arh Celok Lek, 2015,143(7-8):487-493.

[10] 王鈺瑩,余麗梅,陳代雄,等.人羊膜上皮細(xì)胞原位移植對(duì)大鼠急性心肌梗死后心功能和心室重構(gòu)的改善作用[J].臨床心血管病雜志,2014(2):161-165.

[11] Ellison GM, Vicinanza C, Smith AJ,et al. Adult c-kit(pos) cardiac stem cells are necessary and sufficient for functional cardiac regeneration and repair[J]. Cell, 2013,154(4):827-842.

[12] Bolli R, Chugh AR, D'Amario D,et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial[J]. Lancet, 2011,378(9806):1847-1857.

[13] Malliaras K, Makkar RR, Smith RR,et al. Intracoronary cardiosphere-derived cells after myocardial infarction: evidence of therapeutic regeneration in the final 1-year results of the CADUCEUS trial (Cardiosphere-Derived autologous stem cells to reverse ventricUlar dySfunction) [J].J Am CollCardiol, 2014,63(2):110-122.

[14] Chen L,Wang Y, Pan Y, Zhang L, et al. Cardiac progenitor-derived exosomes protect ischemic myocardium from acute ischemia/reperfusion injury[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013,431(3):566-571.

[15] Di Trapani M, Bassi G, Midolo M,et al. Differential and transferable modulatory effects of mesenchymal stromal cell-derived extracellular vesicles on T, B and NK cell functions[J]. Sci Rep, 2016 ,6:24120.

[16] Bian S， Zhang L，Duan L， et al. Extracellular vesicles derived from human bone marrow mesenchymal stem cells promote angiogenesis in a rat myocardial infarction model[J]. J Mol Med (Berl), 2014,92(4):387-397.