微流控芯片技術(shù)在血腦屏障模型構(gòu)建中的應(yīng)用進(jìn)展

杜萌，鄭國俠，王云華

(大連大學(xué)，遼寧大連 116622)

血腦屏障(BBB)包括血-腦、血-腦脊液屏障、腦脊液-腦屏障，是由腦內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞以及星型膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞、基底膜共同構(gòu)成的致密屏障結(jié)構(gòu)。BBB既可以充當(dāng)物理和功能屏障調(diào)節(jié)被動(dòng)、主動(dòng)運(yùn)輸，也可以充當(dāng)新陳代謝和免疫屏障[1,2]，對于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起到十分重要的作用，但BBB的存在也使得98%的小分子物質(zhì)以及幾乎100%的大分子物質(zhì)不能進(jìn)入CNS發(fā)揮作用。傳統(tǒng)的體外BBB模型大致經(jīng)歷了腦微血管碎段模型[3]、體外細(xì)胞培養(yǎng)模型(包含單一微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)模型[4]及血管內(nèi)皮細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型[5]和血管內(nèi)皮細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞共培養(yǎng)模型[6])和3D動(dòng)態(tài)BBB模型[7,8]三個(gè)階段。傳統(tǒng)的體外BBB模型多以Transwell小室為載體進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)，無法再現(xiàn)流體動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)。微流控芯片技術(shù)又稱芯片實(shí)驗(yàn)室，是采用微細(xì)加工技術(shù)，將生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域涉及的樣品預(yù)處理、分離、稀釋、反應(yīng)、檢測等操作集中到一塊微米尺度的芯片上[9]。微流控芯片以微米通道為結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，以取代常規(guī)生物或化學(xué)實(shí)驗(yàn)室功能為目標(biāo)，是交叉學(xué)科的杰出產(chǎn)物，涉及醫(yī)學(xué)、生物、化學(xué)、流體、電子、機(jī)械、材料等研究領(lǐng)域，成為了上個(gè)世紀(jì)90年代影響最為深遠(yuǎn)的重大科學(xué)技術(shù)之一?，F(xiàn)就微流控芯片技術(shù)在BBB模型構(gòu)建中的應(yīng)用進(jìn)展情況做一綜述。

1 微流控芯片技術(shù)的特點(diǎn)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?shí)驗(yàn)材料的不同，微流控芯片主要包括紙芯片[10]、通道式微流控芯片[11]、數(shù)字微流控芯片[12]三大分支。上世紀(jì)80年代末至90年代末，尤其是在研究芯片襯底的材料科學(xué)和微通道的流體移動(dòng)控制技術(shù)得到發(fā)展后，微流控技術(shù)也取得了較大的進(jìn)步。以玻璃為基質(zhì)或玻璃與高分子聚合并重的通道式微流控芯片是目前研究最多的芯片之一。用于制作微流控芯片的材料有單晶硅、玻璃、石英和有機(jī)聚合物，如聚二甲基硅氧烷(PDMS)、環(huán)氧樹脂、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯(PC)等。PDMS作為一種高分子有機(jī)硅化合物，具有良好的化學(xué)惰性、透光性、無毒、電絕緣等特點(diǎn)，常被用來與玻璃結(jié)合制作微流控芯片。微流控芯片上微通道的制作起源于制作半導(dǎo)體及集成電路芯片中使用的光刻和蝕刻技術(shù)，以此技術(shù)為基礎(chǔ)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要在基底材料上刻蝕出不同的通道圖案，并結(jié)合高分子聚合物材料是目前主流芯片制作方法[13]。微流控芯片技術(shù)迅猛發(fā)展，研究人員已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)在芯片上進(jìn)行多種人體器官模型的構(gòu)建，包括芯片血管[14]、芯片肺[15]、芯片心臟[16]、芯片肝[17]等。器官芯片不僅帶來了研究設(shè)備尺寸上的變化，而且在微環(huán)境模擬和器官性能模擬上也有眾多優(yōu)點(diǎn)：①提供三維的細(xì)胞生長空間；②對細(xì)胞施加流體剪切力刺激或模擬人體動(dòng)態(tài)的機(jī)械應(yīng)力，如呼吸時(shí)肺組織的牽拉與擠壓力、血壓等；③即時(shí)供給營養(yǎng)，排出代謝廢物；④透明的芯片使實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀測更容易。

2 微流控芯片技術(shù)在BBB模型構(gòu)建中的應(yīng)用

由于動(dòng)物研究不能夠提供大量平行可控的、相似的內(nèi)環(huán)境用于定量研究，且傳統(tǒng)的體外BBB模型具有流體不可控等缺點(diǎn)，所以自20世紀(jì)90年代微流控技術(shù)問世以來研究人員積極將其用于體外BBB模型的構(gòu)建，現(xiàn)根據(jù)屏障結(jié)構(gòu)的細(xì)胞組成不同分為單一內(nèi)皮細(xì)胞模型及內(nèi)皮細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型和內(nèi)皮細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞共培養(yǎng)模型。

2.1 單一內(nèi)皮細(xì)胞模型 永生化人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞hCMEC/D3可以穩(wěn)定表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD31、VE-cadherin、von Willebrand等，且能夠表現(xiàn)出BBB特性，例如有形成緊密連接蛋白和排出藥物的能力。將hCMEC/D3單獨(dú)培養(yǎng)在Transwell小室中或培養(yǎng)于微流控芯片中，其跨內(nèi)皮電阻值(TEER)大于原代血管內(nèi)皮細(xì)胞與星型膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)所達(dá)到的TEER[18]。Griep等[19]將hCMEC/D3培養(yǎng)于芯片中構(gòu)建了一種微流控芯片BBB模型，使用Transwell小室的PC膜(厚度10 μm，孔徑0.4 μm)模擬基底膜，將其封接在兩層PDMS中間，上下兩層通道分別模擬BBB的內(nèi)外兩側(cè)，結(jié)果顯示hCMEC/D3在芯片中培養(yǎng)至第4天可形成緊密連接蛋白ZO-1。Transwell小室構(gòu)建的BBB模型在第7天時(shí)TEER值為(28.2±1.3)Ω·cm2，而微流控BBB模型為(36.9±0.9)Ω·cm2，當(dāng)細(xì)胞在流體作用下培養(yǎng)時(shí)TEER可達(dá)到120 Ω·cm2。TNF-α影響屏障完整性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)用濃度為1 ng/mL的TNF-α處理細(xì)胞2 h，TEER短時(shí)間內(nèi)從120 Ω·cm2降至20 Ω·cm2，證明了屏障結(jié)構(gòu)的完整性。

Kim等[20]使用3D打印機(jī)打印出外部框架結(jié)構(gòu)，將Ⅰ型膠原蛋白置入其中，并嵌入微針形成4個(gè)直徑為235 μm或360 μm的柱型孔，構(gòu)建了一種體外腦微血管模型。在管腔內(nèi)側(cè)注入鼠腦內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3，檢測發(fā)現(xiàn)bEnd.3培養(yǎng)14 d后已表達(dá)ZO-1。在培養(yǎng)了1、2、3、4、7、14、21 d后分別注入分子量為40 kD的異硫氰酸熒光素-右旋糖苷(FITC-dextran)，結(jié)果顯示熒光素的滲透率隨培養(yǎng)天數(shù)的增加而減少，高滲物質(zhì)甘露醇的注入能顯著增加熒光素的滲透，繼續(xù)培養(yǎng)4 d后膜滲透率逐漸恢復(fù)到較低水平，這些特性都與在體BBB屏障的生理特性一致。

由于目前國際上并沒有關(guān)于構(gòu)建微流控BBB模型的標(biāo)準(zhǔn)，所以即使是用同一種細(xì)胞系構(gòu)建的微流控BBB模型，在TEER、滲透系數(shù)等方面都存在差異，是否考慮到流體剪切力對屏障結(jié)構(gòu)的影響也會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響。

2.2 內(nèi)皮細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型 Panula等[21]首次證實(shí)了從動(dòng)物體內(nèi)分離的腦內(nèi)皮細(xì)胞可以作為體外培養(yǎng)的BBB原型，但是隨著時(shí)間的推移，內(nèi)皮細(xì)胞逐漸喪失了許多體內(nèi)特性，當(dāng)與星型膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)或在星型膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞再次表現(xiàn)為廣泛的纖維連接蛋白形成和低滲透率，提示體內(nèi)固有環(huán)境因素，尤其是細(xì)胞間的相互接觸對細(xì)胞分化和增殖的重要影響。

Booth等[22]構(gòu)建的內(nèi)皮細(xì)胞與星型膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)的芯片中，PC膜用于模擬基底膜結(jié)構(gòu)，上下兩側(cè)的PDMS分別刻有細(xì)胞培養(yǎng)室。在膜上下培養(yǎng)室分別培養(yǎng)鼠內(nèi)皮細(xì)胞bEnd.3和鼠星型膠質(zhì)細(xì)胞C8D1A。3 d后bEnd.3表達(dá)ZO-1，C8D1A表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志物GFAP。TEER測量結(jié)果顯示芯片BBB模型可達(dá)到250 Ω·cm2，Transwell僅為25 Ω·cm2。且在這兩種模型中，內(nèi)皮細(xì)胞與膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)所達(dá)到的TEER均大于內(nèi)皮細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)。在芯片中分別注入不同濃度的組胺后，TEER出現(xiàn)不同程度的下降，并于數(shù)分鐘后恢復(fù)到正常水平。碘化丙錠及不同分子量大小(4、2、70 kD)的FITC-dextran，評(píng)價(jià)膜滲透性結(jié)果顯示顆粒直徑越小的熒光示蹤物越容易透過滲透膜，且共培養(yǎng)體系較單獨(dú)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞具有更低的滲透性。

以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)，基于內(nèi)皮細(xì)胞與膠質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)所構(gòu)建的芯片BBB模型具有更高的TEER、低滲透性和能夠特異性表達(dá)BBB生理結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，是對單一內(nèi)皮細(xì)胞模型的補(bǔ)充與完善，可被用于檢測屏障功能在不同環(huán)境下的變化情況，例如屏障增強(qiáng)或屏障開放藥物，也可以通過滲透測定系統(tǒng)預(yù)測新藥的運(yùn)送速率。

2.3 內(nèi)皮細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞共培養(yǎng)模型 Brown等[23]構(gòu)建了一種四層結(jié)構(gòu)式芯片，在星型膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)室中實(shí)現(xiàn)了原代人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞hBMVEC、原代星型膠質(zhì)細(xì)胞、原代周細(xì)胞、IPS誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞共培養(yǎng)，證實(shí)星型膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基和周細(xì)胞條件培養(yǎng)基能夠促進(jìn)緊密連接蛋白的形成。BBB形成的另一個(gè)重要特性是在流動(dòng)方向上的內(nèi)皮細(xì)胞極化，因此Brown等驗(yàn)證了不同培養(yǎng)條件對內(nèi)皮細(xì)胞極化的影響。結(jié)果顯示，維持在無血清培養(yǎng)基中的內(nèi)皮細(xì)胞幾乎沒有任何肌動(dòng)蛋白束的形成；單獨(dú)培養(yǎng)條件下，65%肌動(dòng)蛋白纖維形成方向與液體流動(dòng)方向一致，隨著周細(xì)胞條件培養(yǎng)基的增加，這個(gè)數(shù)字增至78%；有趣的是，星型膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)基的增加會(huì)促進(jìn)垂直于流體方向肌動(dòng)蛋白纖維的極化。這些結(jié)果表明，流體、血清、星型膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞所產(chǎn)生的某些因子是成熟BBB形成的重要因素。內(nèi)皮細(xì)胞、星型膠質(zhì)細(xì)胞、周細(xì)胞共培養(yǎng)模型考慮到了BBB形成過程中的環(huán)境因素和重要細(xì)胞類型，是目前微流控芯片BBB模型中較為完善的一種。

綜上所述，微流控芯片不僅可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的三維生長，而且可以人為控制液體的流動(dòng)方向，實(shí)現(xiàn)體內(nèi)優(yōu)勢與體外優(yōu)勢的結(jié)合[24]，成為研究體外微流控BBB模型的有力工具。未來微流控芯片BBB模型將可以用來研究藥物滲透性對神經(jīng)元的影響，也可以與不同的神經(jīng)系統(tǒng)疾病模型進(jìn)行整合，從藥代動(dòng)力學(xué)出發(fā)研究藥物滲透過BBB后對不同疾病的治療效果，這將是微流控芯片BBB模型未來研究的重要方向。