防齲的動物實驗研究進展＊

盧 燕，藍 海

齲齒又稱“蛀牙”，是一種常見的牙齒組織被慢性破壞的感染性疾病，由細菌、食物、個體等多種因素引起，影響牙齒的美觀、發(fā)聲等功能［1，2］，若不及時治療，會損害整個牙體造成嚴重的后果。

目前防齲動物的實驗研究主要分為：對致齲菌生物膜的影響而改變致齲能力；抑制牙體脫礦促進再礦化增強牙齒的抗齲作用；從基因層面研究了免疫對致齲的影響，等三個方面。而目前致齲實驗造模一直沿用了1964年Keyes等用的飼料配方［3］，主要通過向適齡大鼠喂養(yǎng)致齲飼料Keyes2000#（全麥粉6%，蔗糖56%，脫脂無糖奶粉28%，酵母4%，苜蓿粉3%，肝臟粉末1%，食鹽2%）。

1 抑菌作用

變形鏈球菌生物膜持久存在于在口腔中是造成齲齒的主要原因之一。Garciad等［4］實驗發(fā)現(xiàn)一種小分子3F1，能夠選擇性靶向變異鏈球菌生物膜，有效地減少體內(nèi)齲齒，而不會影響口腔整體微生物群情況。Kulshrestha等［5］通過在掃描電鏡下觀察膜的完整性，發(fā)現(xiàn)氟化鈣納米顆粒（CaF2－NPs）能抑制變形鏈球菌生物膜的形成，減輕齲損情況。

有學者通過在藥物中增加基質提高溶解度而達到更好的抑菌效果。Li等［6］研究一種提高溶解度的水難溶性醋酸氯正酸的新型納米乳劑（CNE），用掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡檢測變形鏈球菌生物膜，用透射電子顯微鏡觀察變形鏈球菌的細胞膜形態(tài)，結果顯示CNE在體內(nèi)極大地改善了該試劑溶解性和抗微生物活性。

有學者通過深入研究發(fā)現(xiàn)藥物靶向作用于致齲菌的基因。Klein等［7］從大鼠口腔內(nèi)得到菌斑生物膜，研究發(fā)現(xiàn)可同時分析可行的微生物群體和基因表達，從而提供對齲齒傳染性方面的全面評估。Falsetta等［8］評估氟化物新型聯(lián)合療法CT的抗齲作用時，深入研究發(fā)現(xiàn)了CT調(diào)節(jié)生物膜毒力的潛在機制，發(fā)現(xiàn)其主要靶向作用于變形鏈球菌生物膜形成過程中關鍵基因的表達。Bueno－Silva等［9］通過對大鼠接種變形鏈球菌，再用從巴西蜂膠中分離的新戊醇－含維斯體素（NV）每天兩次涂布在大鼠口腔牙齒內(nèi)，用激光共聚焦得到生物膜的胞外多糖（EPS）和細菌成像得到EPS和細菌的生物量、平均厚度和生物膜之前的差異，用優(yōu)化的方案提取和純化 RNA［10］，再進行基因組分析，葡糖基轉移酶（Gtf）活性分析，結果發(fā)現(xiàn)NV的局部應用通過大量破壞葡糖基轉移酶衍生的胞外多糖的合成和與適應性應激反應相關的基因的表達，大量損害變形鏈球菌的生物膜積累。

2 抑制牙齒脫礦促進再礦化

目前體內(nèi)牙齒評分均用Keyes評分法［11］，在體視顯微鏡下對大鼠磨牙光滑面齲、窩溝面齲進行分類計分，齲損程度分為 E、Ds、Dm、Dx 四級，依次代表釉質齲、牙本質淺層齲、牙本質中層齲、牙本質深層齲。

Wu等［12］評估新型黏合劑對二次患齲動物的作用，用顯微CT測量病變的深度和礦物質損失，用齲齒等級劃分，發(fā)現(xiàn)新型黏合劑能顯著降低病變深度和礦物損失，且齲齒等級評分降低。

DE等［13］研究了蜂膠清漆在大鼠體內(nèi)的抗齲作用和其對成纖維細胞的毒性作用，對牙光滑面和溝槽齲齒評分，發(fā)現(xiàn)蜂膠清漆能防止光滑面釉質齲而且顯示低細胞毒性。

Li等［14］研究磷酸鈣納米粒子（NACP）和抗菌二甲基氨基十二烷基甲基丙烯酸酯（DMADDM）摻入復合材料和黏合劑中對大鼠口腔的抗菌和再礦化修復情況，發(fā)現(xiàn)含NACP和DMADDM的復合材料和黏合劑有助于牙本質-牙髓復合體的愈合。

Baptista 等［15］研究了抗微生物光動力療法（APDT）去礦物質作用的短期影響時，在實驗開始后5 d，通過光學相干斷層掃描術（OCT）確認早期齲壞病變。用OCT檢查牙齒脫礦情況，實驗發(fā)現(xiàn)治療前后的光學衰減系數(shù)的變化為15%，齲齒發(fā)展受阻，表明APDT能減少牙礦物質的損失。

3 基因免疫

齲齒相關的病原體首先被成牙本質細胞識別并誘發(fā)發(fā)展為牙髓炎。微生物病原體的初始感應由模式識別受體介導，如Toll樣受體和核苷酸結合寡聚化結構域（NOD）。Hosokawa 等［16］通過流式細胞儀檢測大鼠牙本質細胞KN-3中NODs的表達水平，并用PCR和ELISA分析NOD特異性配體刺激的KN-3細胞中的趨化因子水平。發(fā)現(xiàn)NOD1通過p38-AP-1信號通路上調(diào)趨化因子在成牙本質細胞中表達，提示NOD1可能在牙髓炎的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。

Bao 等［17］研究了鞭毛蛋白-PAc 融合蛋白（KF-rPAc）作為新免疫方案對齲齒的黏膜疫苗的治療效果。實驗發(fā)現(xiàn)，將變形鏈球菌植入大鼠口腔后，通過鼻腔免疫的KF-rPAc可有效促進PAc特異性系統(tǒng)和黏膜抗體應答，并有效抑制齲齒發(fā)展。

Su等［18］研究基因IL-6的表達質粒 pCI-IL-6對編碼變形鏈球菌表面蛋白抗原PAc的抗齲齒DNA疫苗pCIA-P的免疫原性的影響。通過在鼠IL-6基因插入pCI載體構建質粒pCI-IL-6。在大鼠齲齒模型中，pCI-IL-6共免疫大鼠表現(xiàn)出較低的齲齒評分。

Hung等［19］將成年雌性Wistar大鼠用抗齲DNA疫苗pGJA-P/VAX進行鼻內(nèi)免疫，在免疫后的不同時間檢查唾液中的S-IgA抗體水平及其對變形鏈球菌黏附的抑制。使用計數(shù)集落形成單位并使用激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM）確定每個階段的活細菌數(shù)量和生物膜深度。發(fā)現(xiàn)抗齲齒DNA疫苗通過抑制變形鏈球菌初始黏附到牙齒表面上而誘導特異性S-IgA抗體的產(chǎn)生，減少變形鏈球菌薄膜上的積聚，從而預防齲齒。

Yoshioka 等［20］對 9 周齡的 Wister磨牙制備空腔后，對髓細胞進行了基因表達分析，發(fā)現(xiàn)金屬蛋白酶抑制劑19（Timp1）連續(xù)廣泛分布于下方的牙髓中，得出結論Timp1可能在未成熟牙髓細胞中重新激活第三次牙本質形成中發(fā)揮重要作用。

Pan等［21］測試了gcrR基因缺陷的細菌替代療法的潛在抗齲作用，通過同源重組構建突變體，突變型MS-gcrR-def接種于大鼠模型，用激光共聚焦分析生物膜的形態(tài)特征，發(fā)現(xiàn)MS-gcrR-def具有更低的酸產(chǎn)量和更強的定植潛力，體內(nèi)齲齒明顯減少。

在唾液腺和其他部位發(fā)現(xiàn)的趨化因子CCL28有一定的抗菌活性，CCL28集合了攜帶CCR10的免疫細胞，特異性IgA抗體分泌細胞（IgA+ASCs）在膜表面表達CCR10，唾液腺中的IgA+ASC對致齲細菌的特異性免疫防御，CCL28由唾液腺腺泡上皮細胞表達也可以與唾液一起分泌到口腔中［22-29］。Jiang等［30］發(fā)現(xiàn)將重組質粒遞送至大鼠腮腺，能夠在唾液中誘導高水平的CCL28和SIgA，并且唾液中CCL28和SIgA的水平增加維持2 W，用重組質粒處理的大鼠的牙菌斑含有較少的變形鏈球菌。

Shi等［31］實驗發(fā)現(xiàn)含來自沙門菌的重組鞭毛蛋白（Flic）可作為用于抗齲DNA疫苗的黏膜佐劑（pGJA－P/VAX）。PAc特異性IgA反應與抑制牙齒表面變形鏈球菌定植相關，有較好的保護作用，齲病發(fā)生明顯減少。

Dinis等［32］研究了妊娠前母體接種遠緣鏈球菌重組烯醇化酶rEnolase，產(chǎn)下的幼仔具有更高水平的rEnolase特異性唾液IgA和IgG抗體，和較低的齲齒等級評分。

此外，目前有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病也會誘發(fā)齲齒的發(fā)生。Abbassy等［33］用微型計算機體層攝影術（micro－CT）檢測患1型糖尿病大鼠牙釉質和牙本質的礦物質密度和厚度。用組織形態(tài)計量學研究檢測牙本質礦物質沉積和形成的速率。結果顯示牙釉質和牙本質厚度明顯減少（發(fā)育不全），并且牙本質礦物質沉積和形成速率明顯降低。Gutowskal等［34］實驗發(fā)現(xiàn)1型糖尿病大鼠的血清葡萄糖和雌二醇濃度更高；鏈脲佐菌素誘發(fā)的糖尿病中血清鈣鎂濃度顯著高于對照組，牙齒鈣含量有下降趨勢，通過影響牙齒硬組織的礦物組成而誘發(fā)和加劇齲齒。Nakahara 等［35，36］研究了四氧嘧啶誘導的糖尿病大鼠的牙周病病況，病理學檢查大鼠的牙齦炎、邊緣性牙周炎、牙槽骨吸收情況，發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠中，牙周炎癥的發(fā)展與鄰近齲齒的嚴重程度密切相關，并且邊緣牙周炎常常與牙周炎相連。

在兒童早期齲病中，牙菌斑生物膜微生物學研究發(fā)現(xiàn)，大量的變形鏈球菌下會出現(xiàn)白色念珠菌，相反的無變形鏈球菌也能偶爾檢測到白色鏈球菌［37－39］。Falsetta等［40］在大鼠口腔模型中，植入變形鏈球菌，部分再植入白色鏈球菌，實驗結束后進行微生物分析，發(fā)現(xiàn)共感染的動物在斑塊生物膜內(nèi)顯示出比單獨感染任何物種的動物更高水平的感染和微生物攜帶，而且共感染會增強生物膜的毒性，加重齲齒嚴重程度。

目前商業(yè)化的含葡聚糖酶漱口液中加入的葡聚糖酶主要來自真菌。然而，當用于人類口腔時，細菌葡聚糖酶被認為在口腔溫度（約35.5℃）下更加穩(wěn)定和有效，并且適合于工業(yè)應用作為齲齒防止劑［41，42］。 Jiao 等［43］使用來自海洋節(jié)桿菌的葡聚糖酶（Dex410），通過動物體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，在短時間內(nèi)（1.5個月）Dex410和普通漱口劑Biotene均對齲齒有明顯的抑制作用；而對于長期使用 （3個月），只有Dex410對齲齒具有明顯的抑制作用。

Eshqhi等［44］研究含鐵食物對齲齒的作用，通過對大鼠飼養(yǎng)不同種類的飼料，在偏光顯微鏡下觀察牙齒，發(fā)現(xiàn)與不含鐵補充劑的致齲食物相比，接受含鐵補充劑和致齲食物的組中的齲明顯較少。