蝮蛇毒抑制心肌缺血再灌注損傷中血小板活化機制的探討

高恬媛，張根葆，2，靳 文，季 娜

(皖南醫(yī)學院 1.病理生理學教研室;2.蛇毒研究所 安徽省重點實驗室，安徽 蕪湖 241002)

心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)廣泛見于臨床，是造成臨床溶栓治療、冠脈搭橋術(shù)和心臟移植失敗的重要原因。血小板活化因子(platelet activating factor，PAF)是一種磷脂遞質(zhì)，血小板、中性粒細胞、肥大細胞、內(nèi)皮細胞等均可分泌，是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強的脂質(zhì)遞質(zhì)，也是最有效的血小板聚集誘導劑。研究表明，MIRI可促進PAF釋放，激活血小板，促進血栓形成[1-2]。本實驗室前期已經(jīng)成功從皖南蝮蛇粗毒中分離純化出蝮蛇毒血小板抑制因子(platelet inhibitor fromAgkistrodonhalysvenom,AHV-PI),其分子質(zhì)量約31 ku。家兔在體實驗發(fā)現(xiàn)其有抗血小板聚集的作用，與保護血小板超微結(jié)構(gòu)，減少其顆粒內(nèi)容物釋放有關(guān)，但具體作用機制尚不明確[3]。本實驗通過復制大鼠在體心肌缺血/再灌注損傷模型，旨在觀察AHV-PI對其作用及其可能機制，為AHV-PI的臨床應用提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量(250±25)g，清潔級，由蘇州市工業(yè)園區(qū)愛爾麥特科技有限公司提供，許可證編號：SCXK(蘇)20130002。大鼠隨機分為6組(n=6)：正常對照組、I/R模型組、陽性對照組(PAF抑制劑銀杏內(nèi)酯BN52021，4 mg/kg)、AHV-PI低、中、高劑量組(0.05、0.1、0.2 mg/kg)。模型組經(jīng)腹腔注射1 mL的生理鹽水，陽性對照組注射同體積的4 mg/kg銀杏內(nèi)酯B稀釋液，AHV-PI低、中、高劑量組注射同體積的(0.05、0.1、0.2 mg/kg)AHV-PI。正常對照組不復制I/R模型，僅腹腔注射同體積的生理鹽水。

1.2 藥品與試劑 AHV-PI由皖南醫(yī)學院蛇毒研究所提供；銀杏內(nèi)酯(BN52021)購于Sigma公司；血小板活化因子(PAF)ELISA試劑盒購于武漢華美生物工程有限公司；ADP購于Sigma公司；TTC試劑購于Amresco公司。

1.3 儀器 HX-300S動物呼吸機(成都泰盟科技有限公司)；RM6240生物信號采集系統(tǒng)(成都儀器廠)；Model-680酶標儀美國(Bio-Rad公司)；血小板聚集儀(Helena Laboratories公司)。

1.4 I/R模型制備 大鼠腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉(0.3 mL/100g)，麻醉后背部固定于鼠臺，常規(guī)頸部手術(shù)，行氣管插管，連接呼吸機，RM6240 生物信號采集處理系統(tǒng)監(jiān)測Ⅱ?qū)?lián)心電變化。分離胸肌，斷開左側(cè)第2～4肋骨，暴露心臟，撕開心包膜，于肺動脈圓錐與左心耳間，以冠狀靜脈為標志，找到冠狀動脈左前降支，并于冠狀動脈左前降支起始部下2 mm 處用6-0手術(shù)線結(jié)扎，手術(shù)線兩端各套一個細小乳膠管圈，拉緊結(jié)扎線使細小乳膠管壓迫左冠狀動脈前降支而致閉塞。以結(jié)扎后心前區(qū)發(fā)紺伴隨T波高聳或ST段抬高(>0.2 mV)作為結(jié)扎成功的標志。結(jié)扎后立即腹腔注射給藥，結(jié)扎30 min后剪斷結(jié)扎線，再灌注120 min后采集標本。

1.5 標本采集與指標檢測 頸總動脈取血，用3.8%枸櫞酸鈉(1∶9)抗凝，常溫靜置30 min，離心10 min(3000 r/min)收集血漿，冰凍保存，采用酶聯(lián)免疫吸附雙抗體夾心法(ELISA)定量測定PAF含量；將血樣離心(1000 r/min，10 min)后取富含血小板血漿(RPR)，剩余再離心(3000 r/min，10 min)取貧血血小板血漿(PPP)，采用ADP(25 μL，50 μmol/L)誘導比濁法測定血小板聚集率(取血后2 h內(nèi)完成)；剪取心肌組織做好標記后，立即用冰生理鹽水沖凈血跡，吸水后-70℃冰凍10 min，從心底至心尖切成5片，每片厚度2 mm，0.2%TTC 37℃水浴箱中避光孵育20 min，觀察心肌切片顏色變化(由于缺血梗死部位乳酸脫氫酶會失活，TTC與乳酸脫氫酶結(jié)合，梗死部位染成白色，非梗死部位為紅色)，拍照后采用 Image J軟件計算梗死面積。梗死面積百分比(%)= 梗死面積/橫切片總面積×100%[4]。

2 結(jié)果

2.1 AHV-PI對缺血再灌注大鼠血小板聚集率的影響 圖1可見，與正常對照組相比，模型組血小板最大聚集率上升；與模型組相比，AHV-PI中、高劑量組血小板最大聚集率均降低(F=73.64,P<0.05)。

aP<0.05vs.正常組，bP<0.05vs. 模型組。

2.2 AHV-PI對缺血再灌注大鼠血小板活化因子(PAF)含量的影響 表1中可見，與正常對照組相比，模型組中PAF含量增加(P<0.05)；與模型組相比，AHV-PI中、高劑量組均降低(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。

2.3 TTC染色 由圖2可見，AHV-PI低劑量組與模型組的缺血梗死發(fā)白非常明顯，AHV-PI高劑量組TTC染色后沒有明顯的心肌缺血梗死發(fā)白的變化。由圖3可見，與模型組[(48.04±13.93)%]相比，陽性對照組[(10.93±1.95)%]、AHV-PI中劑量組[(14.76±5.79)%]、高劑量組[(3.94±1.03)%]心肌梗死面積百分比均降低(F=25.46，P<0.01)。

a:正常對照組；b:模型組；c:陽性對照組；d：AHV-PI低劑量組(0.05 mg/kg)；e:AHV-PI中劑量組(0.1 mg/kg)；f:AHV-PI高劑量組(0.2 mg/kg)。

圖2 TTC染色后各組心肌染色結(jié)果

組別PAF含量/(ng/mL)正常對照組0．13±0．07b陽性對照組0．17±0．10b模型組5．98±1．32aAHV?PI低劑量組5．16±2．85aAHV?PI中劑量組2．37±0．08abAHV?PI高劑量組0．23±0．06bF27．42P0．00

aP<0.05vs.正常組，bP<0.05vs. 模型組。

aP<0.01vs.模型組，bP<0.01vs.對照組。

圖3 TTC染色后各組心肌梗死面積

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，再灌注損傷會引起血小板的活化聚集[5]，再灌注損傷主要與血小板激活引起冠狀動脈無復流現(xiàn)象有關(guān)。目前臨床上治療ST段抬高的急性心肌梗死最有效的療法[6]是經(jīng)皮冠狀動脈介入手術(shù)，但相當一部分病人手術(shù)后出現(xiàn)心外膜冠狀動脈無復流，這是導致左心室收縮舒張功能障礙的危險因素。無復流現(xiàn)象形成機制包括：腫脹的心肌細胞壓迫微血管；腫脹的毛細血管內(nèi)皮細胞突出到毛細血管腔；心肌細胞攣縮壓迫毛細血管；中性粒細胞堵塞微脈管系統(tǒng)；血小板聚集、微血栓、血小板脂質(zhì)碎片等栓塞毛細血管；微血管床的破壞；毛細血管痙攣和功能障礙,再灌注損傷[6]。其中血小板在再灌注損傷引起無復流現(xiàn)象中扮演重要角色。血小板激活會產(chǎn)生微血栓導致微循環(huán)障礙，也會產(chǎn)生炎癥介質(zhì)、血管活性物質(zhì)導致冠狀動脈無復流，且當去除血小板后會顯著減少無復流區(qū)域[7]。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)AHV-PI可以降低血漿中纖維蛋白原含量，可能具有纖溶酶活性[3]。研究發(fā)現(xiàn)，PAF與受體結(jié)合才能產(chǎn)生活性，結(jié)合后可使纖維蛋白原的結(jié)合位點暴露,血小板與血小板之間相互反應[8]。BN52021是 PAF拮抗劑，是一種銀杏葉提取物，通過降低PAF水平及與潛在的PAF受體結(jié)合產(chǎn)生效應[9]。PAF與其受體結(jié)合的復合物主要通過5種途徑來產(chǎn)生活性：與G蛋白偶聯(lián)，調(diào)控磷脂酶，調(diào)控Ca2+濃度，調(diào)控蛋白激酶，調(diào)控基因表達[1]。本實驗利用BN52021進行陽性對照，旨在探討AHV-PI對再灌注中產(chǎn)生的PAF的影響程度。本研究還發(fā)現(xiàn)模型組血小板聚集率上升，PAF水平升高，TTC染色顯示模型制造成功，AHV-PI中、高劑量組血小板聚集率降低，PAF水平降低，TTC染色梗死面積減少，這說明AHV-PI對大鼠心肌缺血再灌注損傷有修復作用，可以降低血小板的活化聚集。缺血再灌注中，PAF可以通過第二信使IP3、DAG等直接參與，或者通過炎性細胞活化，如血小板，多形核中性粒細胞加重缺血后心肌細胞損傷[10-11]；PAF還可致內(nèi)皮與基底的組織相連蛋白破壞，促進血小板黏附，形成小血栓，大量的炎性細胞聚集并侵入，最后在內(nèi)皮細胞損傷處出現(xiàn)纖維蛋白沉積[12]。

綜上所述，大鼠心肌缺血再灌注損傷時血小板分泌的血小板活化因子增加，AHV-PI可以降低血小板中PAF釋放，減少血小板活化，降低血小板聚集率，減少心肌梗死面積，減輕再灌注損傷。

[1] 袁奇,張小華,喬延江.血小板活化因子及其受體拮抗劑的研究進展[J].中華中醫(yī)藥雜志，2011，26(7):1568-1571.

[2] CLAUDIA PENNA,ELEONORA BASSINO,GIUSEPPE ALLOATTI.Platelet activating factor:the good and the bad in the ischemic/reperfused heart[J].Experimental Biology & Medicine，2011,236(236):390-401.

[3] 黃璐,張根葆,閔志雪,等.蝮蛇毒血小板抑制因子對動脈血栓形成的影響及機制研究[J].中國臨床藥理學與治療學，2012，17(12):1355-1360.

[4] YUAN Z,CAI T,TIAN J,etal.Na/K-ATPase tethers phospholipase C and IP3 receptor into a calcium-regulatory complex [J].Mol Biol Cell,2005,16(9):4034-45.

[5] PAUL A，GURBELVICTOR L，SEREBRUANY STEVEN F,etal.Regional and systemic platelet function is altered by myocardial ischemia-reperfusion[J].Journal of Thrombosis and Thrombolysis，1995,1(2):187-194.

[6] ZHOU H,HE XY,ZHUANG SW,etal.Clinical and procedural predictors of no-reflow in patients with acute myocardial infarction after primary percutaneous coronary intervention[J].World Journal of Emergency Medicine,2014,5(2):96-102.

[7] MEINRAD GAWAZ.Role of platelets in coronary thrombosis and reperfusion of ischemic myocardium[J].Cardiovascular Research，2004，61(3):498-511.

[8] 傅潔民.血小板活化因子對血小板的作用[J].生理科學進展，1989,20(1):40-44.

[9] XIA SH,XIANG XH,CHEN K,etal.Roles of BN52021 in platelet-activating factor pathway in inflammatory MS1 cells[J].World J Gastroenterol,2013,19(25):3969-3979.

[10] BITENCOURT CS,BESSI VL,HUYNH DN,etal.Cooperative role of endogenous leucotrienes and platelet-activating factor in ischaemia-reperfusion-mediated tissue injury[J].J Cell Mol Med,2013,17(12):1554-65.

[11] 金鳴，臧寶霞,吳偉，等.蘆丁拮抗血小板活化因子與受體結(jié)合的作用[J].中草藥，2005，36(3):390-392.

[12] 王志彬,張繼平.血小板活化因子研究進展[J].公共衛(wèi)生與預防醫(yī)學,2008,19(6):46-49.