醫(yī)療器械重復(fù)接觸全身毒性試驗(yàn)中血液標(biāo)本放置時(shí)間的質(zhì)量控制

劉香東 許晶 趙增琳 褚祥宇 屈秋錦 董秀麗 侯麗 山東省醫(yī)療器械產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心 （山東 濟(jì)南 250101）

臨床病理學(xué)是醫(yī)療器械重復(fù)接觸全身毒性評(píng)價(jià)試驗(yàn)中不可缺少的觀察項(xiàng)目，GB/T16886.11中明確要求重復(fù)接觸全身毒性評(píng)價(jià)應(yīng)采用血液學(xué)和臨床生化分析來(lái)研究組織、器官和其他系統(tǒng)的毒性反應(yīng)，并在附錄D中列出了血液學(xué)和臨床生化血液方面的項(xiàng)目。

實(shí)際工作中，醫(yī)療器械重復(fù)接觸全身毒性試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物數(shù)量多（如慢毒僅單劑量組需80只大鼠），實(shí)驗(yàn)人員往往是待所有試驗(yàn)動(dòng)物解剖取完血后集中離心，然后室溫放置。與此同時(shí)，調(diào)試機(jī)器待質(zhì)控合格后，再將離心后的血清成批放進(jìn)樣品盤(pán)測(cè)試。以日立7180生化分析儀為例，80只大鼠血液標(biāo)本，通常全部分析完臨床生化項(xiàng)目（17個(gè)）大約需要3h。

由于動(dòng)物試驗(yàn)的特殊性，生化儀器開(kāi)機(jī)次數(shù)少，需要保證生化儀器的維護(hù)保養(yǎng)和生化試劑的穩(wěn)定性，故解剖當(dāng)天結(jié)束進(jìn)行生化檢測(cè)時(shí)，儀器開(kāi)機(jī)、保養(yǎng)、質(zhì)控調(diào)試等操作時(shí)間較長(zhǎng)，可能會(huì)出現(xiàn)因某一項(xiàng)目質(zhì)控失控而導(dǎo)致當(dāng)天無(wú)法完成檢測(cè)的情況。

血生化檢測(cè)的準(zhǔn)確性不僅與方法、試劑和檢測(cè)儀器的精密度有關(guān)，還受標(biāo)本保存方式、放置時(shí)間等影響[1]。但是有些GLP實(shí)驗(yàn)室關(guān)于血液標(biāo)本處理及檢測(cè)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）中，大多簡(jiǎn)單描述離心速度，離心時(shí)間等，對(duì)離心后血清的放置時(shí)間、檢測(cè)時(shí)限等缺乏詳細(xì)描述。

為保證動(dòng)物試驗(yàn)血液檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠性，本文探討了真空采血管離心前、后放置時(shí)間對(duì)動(dòng)物試驗(yàn)血液標(biāo)本生化檢測(cè)結(jié)果的影響。為動(dòng)物試驗(yàn)血液標(biāo)本保存方式、放置時(shí)間等建立相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，為形成標(biāo)準(zhǔn)文件提供理論基礎(chǔ)。

1.資料與方法

1.1 臨床資料

取10只SD大鼠，雌性各半，編號(hào)為1～10號(hào)。

儀器設(shè)備：真空采血管（無(wú)添加劑Z）。儀器為HITACHI日立7180全自動(dòng)生化分析儀。檢測(cè)項(xiàng)目參照GB/T16886.11-2011附錄D。

1.2 方法

SD大鼠禁食15h后按照40mg/kg·BW的劑量腹腔注射濃度為3%戊巴比妥鈉，麻醉動(dòng)物后腹主動(dòng)脈收集動(dòng)物血液。第一只大鼠準(zhǔn)備真空采血管4支，編號(hào)為1-1至1-4，依次類(lèi)推，第10只大鼠真空采血管編號(hào)為10-1至10-4。其中每只大鼠的1號(hào)管血量至少3mL，2～4號(hào)管至少1mL。

取完血后，采血管室溫靜置約30min，然后將每只大鼠的1號(hào)管放入離心機(jī)中2000r/min，離心20min。離心后，用移液槍小心吸取上部血清（至少1mL），放入生化反應(yīng)杯中，分別檢測(cè)離心后即刻（0h）和放置1h、2h、3h、4h后的臨床生化項(xiàng)目，注意在檢測(cè)放置1h、2h、3h、4h臨床生化項(xiàng)目前要用圓圈振蕩器充分搖勻。按照上述方法，每只大鼠2～4號(hào)管分別繼續(xù)放置1.5h、2.5h、3.5h后離心進(jìn)行臨床生化檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2.結(jié)果

2.1 離心后不同放置時(shí)間臨床生化項(xiàng)目測(cè)定值比較

與離心后0h測(cè)定值比較，離心后2h、3h、4h Na+測(cè)定值雄性動(dòng)物顯著性升高（P＜0.05），雌性動(dòng)物Na+測(cè)定值有增高趨勢(shì)，但差異不顯著（P＞0.05）。其他指標(biāo)雌雄動(dòng)物無(wú)顯著性差異（P＞0.05），結(jié)果見(jiàn)表1。

表1. 真空采血管離心前、后不同時(shí)間臨床生化項(xiàng)目測(cè)定值比較(±s)

表1. 真空采血管離心前、后不同時(shí)間臨床生化項(xiàng)目測(cè)定值比較(±s)

與離心后0h比較，*P＜0.05，#P＜0.01。其他12項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著，不再列出。

性別 指標(biāo) 0h 1h 2h 3h 4h 1.5h 2.5h 3.5h雌性(n=5)AST(U/L) 99.8±13.34 99.9±13.22 100.8±13.63 101.7±13.02 101.9±13.77 136.1±14.22#157.8±11.21#174.8±15.71#GLU(mmol/L) 7.3±0.69 7.37±0.73 7.32±0.73 7.37±0.80 7.46±0.84 6.4±0.92 5.7±0.95# 5.4±0.80#Ca2+(mmol/L) 2.54±0.06 2.58±0.05 2.58±0.06 2.64±0.10 2.50±0.05 2.46±0.06 2.43±0.08# 2.45±0.07 Na+(mmol/L) 141.3±1.12 142.0±1.13 142.3±0.68 143.0±1.19 144.6±3.21 141.2±1.31 140.8±1.17 140.8±1.30 Cl-(mmol/L) 102.6±0.92 102.8±0.88 103.1±0.96 103.0±1.26 104.3±2.91 102.3±1.46 102.2±1.40 101.8±1.57 AST(U/L) 114.9±10.23 115.4±9.77 116.5±9.96 116.6±10.18 117.2±10.00 154.0±23.98*184.8±22.19#199.8±21.88#GLU(mmol/L) 7.29±0.58 7.34±0.58 7.33±0.58 7.37±0.58 6.8±1.26 6.3±0.76 5.7±0.47# 5.4±0.40#Ca2+(mmol/L) 2.46±0.12 2.50±0.12 2.53±0.14 2.48±0.14 2.41±0.11 2.40±0.13 2.36±0.07 2.40±0.08 Na+(mmol/L) 142.0±0.75 142.5±0.58 143.0±0.53* 143.5±0.65# 144.3±0.56# 141.8±0.30 141.0±1.51 142.0±0.51 Cl-(mmol/L) 103.4±0.95 103.5±0.93 104.1±0.79 104.0±0.89 104.5±0.75 102.5±0.42 101.8±1.20 102.0±0.79*雄性(n=5)

2.2 離心前后不同放置時(shí)間臨床生化項(xiàng)目測(cè)定值比較

與離心后0h測(cè)定值比較，雌雄兩組動(dòng)物放置1.5h、2.5h、3.5h后AST均顯著性升高（P＜0.01），放置2.5h、3.5h后GLU均顯著性降低（P＜0.01），放置2.5h后雌性動(dòng)物Ca2+顯著性降低（P＜0.01），放置3.5h后雄性動(dòng)物Cl-顯著性降低（P＜0.01），結(jié)果見(jiàn)表1。

3.討論

標(biāo)本離心后放置2h、3h、4h對(duì)Na+測(cè)定值有明顯影響。這是由于血清中水分的蒸發(fā)而引起測(cè)定結(jié)果的偏高[2]。血清因水分蒸發(fā)而濃縮是影響測(cè)定結(jié)果的一個(gè)不容忽視的因素[3]。放置時(shí)間越長(zhǎng)，血清濃縮就越嚴(yán)重，放置時(shí)間超過(guò)4h大多數(shù)生化指標(biāo)會(huì)有不同程度的增高[4]。為防止血清中水分的蒸發(fā)，生化標(biāo)本不要長(zhǎng)時(shí)間敞口放置于室溫條件下，等待檢測(cè)的生化樣本最好放置于2～8?C冰箱加蓋密閉保存[5]。

標(biāo)本放置1.5h、2.5h、3.5h后離心測(cè)定AST顯著性升高（P＜0.01），這是因?yàn)檠逯蠰-谷氨酸脫氫酶（GLDH）能夠催化α-酮戊二酸和NH3生成谷氨酸，同時(shí)NADH氧化為NAD+使測(cè)試結(jié)果增高[6]。

GLU由于糖酵解的作用，放置時(shí)間越長(zhǎng)其測(cè)定值越低[1,7]?？赡苡捎谘簶?biāo)本種屬差異，離心速度、離心時(shí)間等原因，文獻(xiàn)關(guān)于GLU水平顯著性降低的放置時(shí)間說(shuō)法不一。有文獻(xiàn)報(bào)道，放置3h后GLU水平明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[8]。也有文獻(xiàn)報(bào)道普通真空采血管血清葡萄糖在4h內(nèi)有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）[7]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果是標(biāo)本放置2.5h后GLU測(cè)定值顯著性降低（P＜0.01）。

標(biāo)本放置2.5h后雌性動(dòng)物Ca2+顯著性降低（P＜0.01）。血液標(biāo)本PH值的改變對(duì)Ca2+影響較大，PH升高，Ca2+降低。采血后最好在密閉試管中離心后立即測(cè)定，避免因CO2丟失造成PH升高[6]。放置3.5h后雄性動(dòng)物Cl-顯著性降低（P＜0.01）。CO2通過(guò)彌撒進(jìn)入紅細(xì)胞，生產(chǎn)HCO3-從紅細(xì)胞進(jìn)入血清，并和血清中Cl-進(jìn)行交換，導(dǎo)致Cl-濃度降低[9]。

總之，標(biāo)本離心后放置時(shí)間不同，對(duì)雌雄動(dòng)物血液生化指標(biāo)變化影響趨勢(shì)一致。血生化檢測(cè)中，標(biāo)本放置時(shí)間以及因放置時(shí)間導(dǎo)致的血清水分蒸發(fā)、CO2丟失等是影響血生化檢驗(yàn)結(jié)果的重要因素。在醫(yī)療器械重復(fù)接觸全身毒性實(shí)驗(yàn)中，由于解剖工作量較大，獲取的動(dòng)物血液樣本時(shí)間相差較大，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果可能出現(xiàn)一定的偏差。為降低放置時(shí)間對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果的影響，建議在標(biāo)準(zhǔn)操規(guī)程中明確規(guī)定：取得血液標(biāo)本后，應(yīng)盡可能先離心，然后采取分批測(cè)試或優(yōu)先測(cè)試AST、GLU、ISE等不穩(wěn)定項(xiàng)目，同時(shí)待測(cè)血清應(yīng)轉(zhuǎn)移至帶蓋的EP管中2～8?C密閉保存，并在4h完成其他項(xiàng)目的檢測(cè)。

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